水煮藕帶貯藏期非酶褐變的主要影響因素探究

曹一菲，嚴守雷,2,*，李 潔,2，王清章,2

（1.華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070；2.湖北省水生蔬菜保鮮加工工程技術研究中心，湖北 武漢 430070）

藕帶又名藕鞭、藕梁、藕苫、藕結、蓮標、藕腸子，是蓮（Nelumbo nuciferaGaertn.）生長前期的地下幼嫩根狀莖[1-2]。新鮮的藕帶脆性好、風味佳、營養豐富。藕帶中含4.82%～5.29%（質量分數，下同）干物質、0.51%～0.79%粗纖維、0.80%蛋白質、1.47%～1.60%總糖，水分質量分數高達90%以上，具有藥用價值，《本草綱目》記載，藕帶“功與藕同”[3]。隨著城鎮市民消費能力的提升，藕帶的需求量日益增長，其保鮮加工貯藏技術也有了很大的發展。關健等[4]采用0.25%植酸+1.0% CaCl2+0.5%抗壞血酸的復合保鮮劑對藕帶進行罐裝處理，得到可以在常溫下放置180 d的罐裝藕帶；肖萌等[5]研究得出6 ℃低溫下更利于藕帶保鮮，在此溫度下，藕帶中的多酚氧化酶活性較低，脆度保持良好，有助于延緩藕帶組織的衰老；李珊等[6]利用2%殼聚糖涂膜藕帶后在0～5 ℃的低溫環境下貯藏，得到短期內具有良好品質的藕帶。藕帶采摘后極易褐變，甚至發黑，這給采后的運輸、貯存及深加工帶來很大的不便和困難。水煮藕帶是新鮮藕帶在采摘當天立即經過一系列工業化加工如燙漂、灌湯汁、真空包裝及殺菌等步驟得到的一種工業化藕帶產品，這種藕帶貨架期更長，不受時間空間的影響，可彌補非采摘期的市場空缺。

褐變是影響藕帶制品貨架期和降低商品價值的主要因素之一。食品的非酶褐變是指食品在加工過程中和加工后沒有酶參與下產生的褐變，包括美拉德反應、焦糖化反應、抗壞血酸降解反應和多酚自氧化反應[7-10]。其中還原糖、抗壞血酸、氨基酸和總酚等關鍵組分直接或間接參與非酶褐變反應，這些成分的含量和活性決定了非酶促褐變的反應程度和速率。盡管已經有文獻報道加工食品如白巧克力[11]，白葡萄酒[12]和蜂蜜[13]的非酶褐變機理。但在以往的研究中，對水煮藕帶貯藏期非酶褐變的機理研究尚且不足。

本實驗以當天采摘的新鮮藕帶作實驗樣品，通過色澤參數L*、a*和b*值和褐變度反映低透氧袋處理組和高透氧袋處理組藕帶貯藏60 d過程中褐變情況，同時對藕帶中抗壞血酸、總酚、還原糖、游離氨基酸組分進行定性定量分析，并通過主成分分析和相關性分析找出藕帶中影響非酶褐變的主要因素，為改善水煮藕帶的品質和延長其產品貨架期提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藕帶于實驗當天采購于湖北省武漢市華中農業大學菜市場，采摘時間為2019年5月23日。

低透氧包裝袋（透氧率為2.31 cm3/（m2·d·Pa））、高透氧包裝袋（透氧率為57.11 cm3/（m2·d·Pa））[14]泰興市旭日包裝有限公司。

草酸、抗壞血酸、NaHCO3、無水乙醇、無水碳酸鈉、沒食子酸、福林試劑、葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、亞硫酸鈉、乙酸（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司；2,6-二氯酚靛酚鈉（分析純）西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；檸檬酸、抗壞血酸、NaHSO3、EDTA-2Na、CaCl2（均為食品級）上海維塔化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HH-2數顯恒溫水浴鍋 金壇區西城基銘實驗儀器廠；電子萬用爐 北京市永光明醫療儀器有限公司；高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；CS-30電子天平 上海花潮電器有限公司；JY502-電子天平上海精平電子儀器有限公司；Sartorius萬分之一分析天平奧豪斯儀器（上海）有限公司；Ultra-Scan Pro色差儀 美國HunterLab公司；UV-1800紫外-可見分光光度計 島津（上海）實驗器材有限公司；高速冷凍離心機 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；L-8900全自動氨基酸分析儀 日本日立公司；LGJ-18真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司；DW-86L626超低溫冰箱海爾集團公司。

1.3 方法

1.3.1 水煮藕帶的制備

選取新鮮、均勻、無損傷、無褐變及無嚴重病蟲害的藕帶，清洗表面的泥沙等污物，切成長2～3 cm均勻的小段，將切好的藕帶段用流動的自來水漂洗一次，在100 ℃的0.2%檸檬酸+0.1%抗壞血酸溶液中漂燙2 min，撈出后放在蒸餾水中冷卻，甩干水分后，采用低透氧包裝袋和高透氧包裝袋進行包裝。每次稱取100 g左右的藕帶，與湯汁按1∶1（m/V）共同灌入包裝袋進行真空包裝，浸泡藕帶的湯汁為：0.02% NaHSO3+0.05% EDTA-2Na+0.1% CaCl2+0.1%乙酸。然后將包裝好的藕帶在沸水鍋中殺菌15 min，撈出后自來水冷卻，在室溫下貯藏60 d，每隔10 d測定一次理化指標，測定游離氨基酸和還原糖含量時，將樣品凍干、過60 目篩得到粉末后再測定，凍干樣品不用時保存在-80 ℃超低溫冰箱中。蒸餾水和自來水均于實驗當天取自實驗室水管，具體溫度與實驗當天氣溫有關。

1.3.2 藕帶表皮色澤、藕帶浸沒液褐變度的測定

參考Gan Renyou等[15]的方法采用色差儀測定兩組藕帶的表皮色澤。以標準白板為校準對象，先用白板校準色差計，然后在同樣的光源下測定藕帶樣品，讀取白度L*值、紅綠度a*值、黃藍度b*值，同時按下式計算總色差ΔE。ΔE能夠反映貯藏開始時與貯藏一段時間后藕帶色澤的差異，ΔE值變化越大，表明色澤差異越大。

式中：L0＝100、a0＝0、b0＝0，表示標準白板的色澤值。

藕帶浸沒液褐變度測定參考Wegener等[16]的方法，取不同貯藏期的藕帶浸泡湯汁30 mL置于50 mL離心管中，在10 000 r/min下離心5 min，收集上清液，以蒸餾水作參照，在420 nm波長處測定上清液吸光度，并以A420nm表征褐變度。

1.3.3 抗壞血酸含量的測定

抗壞血酸含量的測定采用2,6-二氯靛酚滴定法[17]。

1.3.4 總酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteu法，以沒食子酸為標準品，對不同貯藏期藕帶進行總酚含量的測定[18]。

1.3.5 還原糖含量的測定

采用3,5-二硝基水楊酸法進行還原糖含量的測定[19]。

1.3.6 游離氨基酸含量的測定

游離氨基酸含量的測定參考齊建雙等[20]的方法，使用全自動氨基酸自動分析儀進行檢測。每個樣品測定2 組平行。

1.4 數據統計分析

除特殊說明外，所有指標均平行測定3 次，結果以平均值±標準差表示。所有數據均用Excel軟件建立數據庫，采用SPSS 22.0軟件進行數據分析，相關性分析采用Pearson法雙側檢驗。采用主成分分析法提取公共成分，成分旋轉方法采用方差最大正交旋轉[21-22]。利用Origin 2018軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同透氧率包裝袋對水煮藕帶色澤和褐變度的影響

由圖1可知，藕帶在60 d貯藏期中，低透氧袋處理組和高透氧袋處理組的L*值、a*值、b*值以及總色差ΔE呈現出不同的變化情況。隨著貯藏期的延長，低透氧袋處理組藕帶的L*值、a*值、b*值以及總色差ΔE變化不大；高透氧袋處理組藕帶L*值持續下降，a*值和b*值顯著上升，造成總色差ΔE顯著上升（P＜0.05）。由于L*值是評價樣品的白度，a*值是評價樣品在紅色到綠色區間變化的參考值，b*值是評價樣品的黃化程度，上述的變化趨勢反映出高透氧袋處理組藕帶的褐變程度更深，低透氧袋處理組藕帶的褐變程度較小，說明氧氣的透過率直接影響藕帶的褐變程度。由于在貯藏過程中，藕帶一直浸泡在溶液中，因此藕帶中的褐變色素會溶解到浸沒液中，造成藕帶浸沒液的褐變度上升，在對藕帶的表面色度進行檢測的基礎上，同時測定了兩個處理組中藕帶浸沒液的褐變度A420nm。如圖2所示，在60 d貯藏期中，低透氧袋處理組中藕帶浸沒液的褐變度略有上升，但上升幅度不大，高透氧袋處理組中藕帶浸沒液的褐變度上升顯著（P＜0.05）。進一步說明，隨著貯藏時間的延長，高透氧袋處理組的褐變程度較低透氧袋處理組更嚴重，氧氣是造成藕帶非酶褐變的重要因素。

圖1 不同包裝袋處理組藕帶貯藏過程中L*（A）、a*（B）、b*（C）、ΔE （D）及表觀（E）變化Fig.1 Changes in L* (A), a* (B), b* (C), ΔE (D) and appearance (E) in boiled lotus sprout in different packaging bags during storage

圖2 不同包裝袋處理組藕帶貯藏過程中浸沒液褐變度的變化Fig.2 Changes in browning degree A420 nm of immersed solution of boiled lotus sprout during storage

2.2 不同透氧率包裝袋對水煮藕帶抗壞血酸含量的影響

圖3 不同包裝袋處理組藕帶貯藏過程中抗壞血酸含量的變化Fig.3 Changes in ascorbic acid content in boiled lotus sprout in different packaging bags during storage

在非酶褐變反應動力學中，抗壞血酸作為抗壞血酸氧化褐變的一種呋喃前體，其含量是影響褐變反應的特定參數之一[23]。因此，檢測藕帶中抗壞血酸含量的變化，對解析非酶褐變的機理具有重要意義。如圖3所示，高透氧袋處理組藕帶抗壞血酸含量在貯藏期前10 d顯著減少，10～30 d緩慢下降，30～60 d抗壞血酸消耗殆盡。而低透氧袋處理組藕帶中抗壞血酸含量在60 d貯藏期內含量雖略有下降，但下降幅度不大，在貯藏結束時含量仍較高。說明低透氧袋對藕帶中的抗壞血酸起到保護作用，而高透氧包裝袋對抗壞血酸的保護作用較弱，高透氧包裝袋內的藕帶抗壞血酸更易被氧化，抗壞血酸氧化產物參與了藕帶非酶褐變進程。

2.3 不同透氧率包裝袋對水煮藕帶總酚含量的影響

圖4 不同包裝袋處理組藕帶貯藏過程中總酚含量的變化Fig.4 Changes in total phenolic content in boiled lotus sprout in different packaging bags during storage

酚類物質是果蔬體內的一種次生代謝產物，在氧氣的存在下，易發生自身氧化反應，產生非酶褐變反應，引起藕帶色澤改變。由圖4可知，在貯藏的前20 d，兩組處理組藕帶中總酚含量均有不同程度的下降，高透氧袋處理組下降幅度更大；在貯藏20～30 d時，兩組處理組藕帶中總酚含量快速上升；貯藏30 d以后，高透氧袋處理組藕帶總酚含量顯著下降（P＜0.05），在60 d時總酚含量下降到第0天的27.46%，說明大部分的多酚被消耗；低透氧袋處理組藕帶總酚含量下降趨勢不顯著，在60 d時總酚含量下降到第0天的81.63%，下降幅度不大。本實驗中對總酚的檢測方法是基于Folin-Ciocalteu法，Folin-Ciocalteu試劑在堿性條件下可被酚類化合物還原呈藍色（鉬藍和鎢藍混合物），藍色深淺與濾液中酚類物質含量成正比[18]。因此不同包裝袋處理組藕帶貯藏30 d時總酚含量快速上升且其值高于其他時期，可能是由于藕帶在酸性條件下貯藏，經過前30 d左右的貯藏后，藕帶中結合態多酚分解成為了游離態多酚，而游離態多酚含量的增加導致其與福林酚試劑結合檢測后所測得的總酚含量明顯上升。在果蔬的非酶褐變中，多酚的自氧化褐變是果蔬制品褐變的重要原因之一[24-25]。高透氧袋處理組中，隨著藕帶褐變程度的加深，總酚含量明顯下降，說明藕帶多酚自氧化參與了褐變進程。

2.4 不同透氧率包裝袋對水煮藕帶還原糖含量的影響

圖5 不同包裝袋處理組藕帶貯藏過程中還原糖含量的變化Fig.5 Changes in reducing sugar content in boiled lotus sprout in different packaging bags during storage

還原糖與游離氨基酸之間發生的羰氨反應所得到的產物是導致果蔬加工品非酶褐變的因素之一[26-27]。由圖5可知，高透氧袋處理組藕帶和低透氧袋處理組藕帶中還原糖含量在30 d左右有所上升，由此猜測，美拉德反應的發生可能是從第30天左右開始發生，并在30 d后的貯藏過程中美拉德反應較第一個月更為活躍，有可能是因為抗壞血酸在貯藏的前30 d大量消耗，使pH值增加，促進了美拉德反應的發生。

2.5 不同透氧率包裝袋對水煮藕帶游離氨基酸組分含量的影響

由表1、2可知，低透氧袋處理組藕帶共檢測出13 種游離氨基酸，高透氧袋處理組共檢測到10種游離氨基酸，低透氧袋組的游離氨基酸種類多3 種，分別是脯氨酸、組氨酸、精氨酸。由表1可以看出，低透氧袋組檢測到的13 種游離氨基酸中，只有甘氨酸、組氨酸和精氨酸含量在貯藏期間變化不顯著（P＞0.05），其余的游離氨基酸含量均變化顯著（P＜0.05），除了蘇氨酸含量在貯藏過程中逐漸減少外，其余9 種氨基酸含量在貯藏過程中上下波動。由表2可以看出，高透氧袋處理組的10 種游離氨基酸中，只有甘氨酸含量變化不顯著（P＞0.05），其余的游離氨基酸含量均變化顯著（P＜0.05），其中蘇氨酸含量在貯藏過程中逐漸減少，可能是因為蘇氨酸在初始總游離氨基酸中占比最高，最先參與美拉德反應，Noda等的研究結果表明，蘇氨酸是參與美拉德反應的重要底物，這可能與蘇氨酸的化學結構有關[28]；γ-氨基丁酸含量逐漸上升，其余8 種氨基酸含量在貯藏過程中上下波動。

表1 不同貯藏期低透氧袋處理組水煮藕帶游離氨基酸組分含量的變化Table 1 Free amino acid composition of boiled lotus sprout packaged in low oxygen-permeable bags during different storage

表2 不同貯藏期高透氧袋處理組水煮藕帶游離氨基酸組分含量的變化Table 2 Free amino acid composition of boiled lotus sprout packaged in high oxygen-permeable bags during storage

2.6 高透氧袋處理組藕帶褐變色澤參數與各致褐變成分的主成分分析和相關性分析結果

表3 高透氧袋處理組藕帶成分分析提取的主成分特征值和貢獻率Table 3 Eigenvalues and contribution to total variance of principal components

通過主成分分析法的降維思維，將多個變量信息綜合到較少的幾個變量上，解釋藕帶中的多種致褐變因子變量信息，便于找出更主要的致褐變因子[29]。本研究利用SPSS 22.0軟件對高透氧袋處理組藕帶色澤參數和各致褐變成分進行成分分析，利用主成分分析方法，提取特征值大于1的主成分，共得到3 個主成分。如表3所示，這3 個主成分對樣本方差的累積貢獻率達到了96.339%，綜合表達了樣品褐變因子組成的大部分信息，同時也反映了原始變量信息。其中，第一主成分PC1的貢獻率達到了77.746%，第二主成分PC2的貢獻率為12.402%，第三主成分PC3的貢獻率為6.191%，可見第一主成分PC1占據了主要的貢獻率。

表4 提取主成分的成分負荷Table 4 Loading matrix of principal components

由表4可知，提取主成分的成分負荷顯示，主成分PC1中載荷在0.8以上的有L*值、a*值、b*值、ΔE和總酚、還原糖、天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、γ-氨基丁酸含量，其中b*值、還原糖含量和谷氨酸含量的成分載荷最高，分別為0.980、0.970、0.955，這些致褐變因子與藕帶褐變的表觀色澤關系密切，貯藏期間其變化可能直接影響樣品的表觀色澤。第2、3個主成分中色澤參數的載荷偏低，沒有載荷在0.8以上的致褐變因子，主成分PC2、PC3可能只是對藕帶在貯藏過程中變化的一個輔助解釋，與色澤參數的變化關系不顯著。因此，僅對主成分PC1和PC2的成分載荷作散點圖，得到圖6，并對色澤參數與致褐變因子變量進行皮爾遜相關性分析，得到表5。

圖6 高透氧袋處理組藕帶致褐變成分與色澤參數的載荷分析Fig.6 PCA Loading plot for causal factors of browning and color parameters in lotus sprout packaged in high oxygen-permeable bags

由圖6可看出，由于第二主成分PC2的貢獻率僅為12.402%，因此，在不考慮主成分PC2的情況下，胱氨酸、蘇氨酸、總酚、抗壞血酸含量和L*值的距離較近，說明這4 種致褐變因子的變化直接影響藕帶樣品的表觀白度。a*值、b*值、ΔE、A420nm與還原糖、天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、γ-氨基丁酸、賴氨酸含量的距離較近，說明這10 種致褐變因子的變化直接影響藕帶樣品的表觀紅度、黃度、總色差及褐變度。

表5 色澤參數與抗壞血酸、總酚、還原糖和游離氨基酸含量之間的相關系數Table 5 Correlation coefficients between color parameters and ascorbic acid, total phenol, free reducing sugar and free amino acid contents

由表5可知，代表藕帶樣品表觀的白度L*值與抗壞血酸、總酚、蘇氨酸、谷氨酸含量呈顯著正相關；代表藕帶樣品表觀的紅度a*值與抗壞血酸、總酚、蘇氨酸含量呈顯著負相關，與還原糖、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸含量呈顯著正相關；代表藕帶樣品表觀的黃度b*值與總酚和蘇氨酸含量呈顯著負相關，與還原糖、天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、γ-氨基丁酸含量呈顯著正相關；總色差ΔE與總酚、抗壞血酸、蘇氨酸含量呈顯著負相關；藕帶湯汁浸沒液的褐變度A420nm與總酚含量呈顯著負相關，與天冬氨酸含量呈顯著正相關。相關性分析結果表明，與3 個及3 個以上色澤參數顯著相關的有總酚、抗壞血酸、蘇氨酸、谷氨酸含量，因此抗壞血酸、總酚、蘇氨酸、谷氨酸含量是非酶褐變的主要影響因素，說明多酚自氧化褐變、抗壞血酸氧化褐變以及美拉德反應對藕帶非酶褐變有不同程度的影響。其中，總酚含量變化與所有色澤參數均顯著相關，同時，大量研究表明，多酚自氧化與熱加工果蔬制品褐變密切相關[30-32]。由此推斷，多酚自氧化反應是水煮藕帶貯藏期間最主要的非酶褐變反應。

3 結 論

本研究綜合測定了兩種不同透氧率包裝袋中水煮藕帶樣品的色度參數、褐變度和抗壞血酸含量、總酚含量、還原糖含量、游離氨基酸組分含量。從描述性分析結果可以看出，隨著貯藏時間的延長，高透氧袋處理組的褐變程度較低透氧袋處理組更高。對高透氧袋處理組藕帶的色澤參數與致褐變因子進行了主成分分析和相關性分析。主成分分析結果得出：胱氨酸、蘇氨酸、總酚、抗壞血酸含量直接影響藕帶樣品的表觀白度L*值；還原糖、天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、γ-氨基丁酸、賴氨酸含量變化直接影響藕帶樣品a*值、b*值、ΔE、A420nm。相關性分析結果表明，與3 個及3 個以上的色澤參數顯著相關的有總酚、抗壞血酸、蘇氨酸、谷氨酸含量，其中總酚含量與所有色澤參數均顯著相關，因此抗壞血酸、總酚、蘇氨酸、谷氨酸含量是非酶褐變的主要影響因素，說明多酚自氧化褐變、抗壞血酸氧化褐變以及美拉德反應對藕帶非酶褐變有不同程度的影響，并初步認為多酚自氧化反應是最主要的非酶褐變反應。