竹葉抗氧化物/酪蛋白酸鈉/乳清分離蛋白可食膜的制備和性能分析

汪 敏，陳潔瑩，徐 磊,,*，蔣希芝，馮 敏

（1.農業農村部長江中下游設施農業工程重點實驗室，江蘇省農業科學院農業設施與裝備研究所，江蘇 南京 210014；2.江蘇銀寶農業科學研究院有限公司，江蘇 鹽城 224014）

可食膜是以天然生物大分子為基材，添加增塑劑等輔助成分制成的一種可食用、綠色環保、具有保鮮功能的包裝材料。可食膜主要通過阻礙水分、氣體和溶質等的遷移來防止食品變質和微生物污染，延長食品貨架期[1]。基于對環境資源保護和食品安全性等問題的考量，近年來可食膜的制備和應用逐漸成為國內外研究的熱點[2-3]。

乳清分離蛋白是奶酪加工工業中的一種副產物，具備可食用、阻隔性優、可生物降解等優良性能[4]，同時具備較佳的成膜能力，可以制備成透明度高、柔韌性好的高分子膜[5]。目前，國內外關于乳清蛋白膜制備和應用的報道較多。Osés等[6]用乳清蛋白可食膜保護富含多不飽和脂肪酸的食品；Silva等[7]將果膠添加至乳清分離蛋白中以改善可食膜的性能。蛋白膜的成膜機理是蛋白質分子在加熱條件下三級結構發生變化，內部基團暴露出來，在干燥過程中蛋白分子間生成新的二硫鍵，得到結構致密的膜[8]。而多種蛋白分子同時加熱變性，干燥過程中蛋白鏈間發生更強烈的交聯，所形成膜性質更優[9]。酪蛋白酸鈉具有較好的熱穩定性，分子中含有疏水基團和親水基團，具有良好的成膜性、阻氣性和乳化性[10]。雷橋[11]將乳清分離蛋白與酪蛋白酸鈉結合制備成復合蛋白膜，其可作為一種綠色環保的可食性包裝材料。

食品在貯藏過程中易受微生物的侵害，而蛋白膜自身營養豐富，在食品保鮮應用中存在抗菌性能不足的劣勢[12]。在蛋白溶液中添加抗氧化劑、抗菌劑等所制備的復合膜對食品的保鮮可能具有更好的效果[13-14]。Ramos等[15]將乳酸、低聚殼聚糖等添加至乳清分離蛋白中以提高可食膜的抗菌性能。竹葉抗氧化物是從一至兩年生的竹葉中提取的抗氧化物質，有效成分包括黃酮類、酚酸類和內酯類化合物，具有較強的抗氧化和抑菌作用[16]。鑒于其理化性質較穩定、安全性高、天然營養、可生物降解等諸多優點，現已初步應用于各類食品中[17-18]。目前鮮見將竹葉抗氧化物添加至乳清蛋白成膜液中以增強可食膜的抗菌、抗氧化性的報道。本實驗以乳清分離蛋白為成膜基材，添加竹葉抗氧化物、酪蛋白酸鈉以甘油為增塑劑，采用延流成膜法制備竹葉抗氧化物/酪蛋白酸鈉/乳清分離蛋白復合可食膜（antioxidant of bamboo leaves/sodium caseinate/whey protein isolate composite film，ASWF）。分析各成膜因素（成膜材料質量比、pH值、甘油質量濃度）對可食膜性能的影響，并對可食膜進行結構表征及保鮮效果測定，以期為竹葉抗氧化物的應用及可食膜的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清分離蛋白（蛋白質量分數高于90%） 美國Hilmar公司；酪蛋白酸鈉（食品級） 上海麥克林生化科技有限公司；甘油（食品級） 濟南雙萍化工科技有限公司；水溶性竹葉抗氧化物（黃色或棕黃色的粉末，無異味；總黃酮質量分數不低于30%） 上海夢荷生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

標準單用型螺旋測微器（0.001 mm） 東莞晶研儀器科技有限公司；FA2004電子分析天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；85-2恒溫磁力攪拌器 常州國華電器有限公司；S20臺式pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HH-8數顯恒溫水浴鍋 常州智博瑞儀器制造有限公司；SD恒溫恒濕箱 天津塞得利斯實驗分析儀器制造廠；GZX-9070數顯鼓風干燥箱 上海博迅實業有限公司；HY-0580電子萬能材料試驗機 上海衡翼精密儀器有限公司；UV-3200PC紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；Nicolet iS-50傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Scientific公司；EVO-LS10掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 德國Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 可食膜的制備

圖1為ASWF的制備流程。稱取乳清分離蛋白10 g，于100 mL常溫去離子水中攪拌溶解；稱取適量酪蛋白酸鈉，分散于去離子水中；稱取適量竹葉抗氧化物，分散于去離子水中。將上述3 種溶液混合，加入適量甘油，調節pH值，磁力攪拌，充分混合后將其于85 ℃恒溫水浴中加熱30 min，使蛋白質變性，制備成復合蛋白膜溶液。將成膜溶液真空脫氣（0.09 MPa、2 h），平板延流，55 ℃恒溫鼓風干燥成膜。將干燥后的膜樣品置于恒溫恒濕箱（23 ℃、相對濕度50%）中平衡48 h，然后進行性能指標測定。

圖1 可食膜制備工藝流程Fig.1 Flow chart of the preparation process of edible films

1.3.2 膜性能指標測定

1.3.2.1 厚度

在可食膜樣品上隨機均勻選取5 個測量點（中間1 個、周圍4 個），采用螺旋測微器測量其厚度，計算平均值，單位mm。

1.3.2.2 機械性能

參考GB/T 1040.1—2018《塑料 拉伸性能的測定第1部分：總則》[19]和GB/T 1040.3—2006《塑料 拉伸性能的測定 第3部分：薄膜和薄片的試驗條件》[20]，采用電子萬能材料試驗機測定可食膜的斷裂拉伸強度及斷裂伸長率。將樣品膜裁剪成150 mm×20 mm的矩形，固定在儀器夾具上，實際測量長度為100 mm，測試速率為300 mm/min，每個樣品平行測10 組，計算平均值。斷裂拉伸強度和斷裂伸長率分別按公式（1）、（2）計算。

式中：F為試樣發生斷裂時對應負荷/N；b為試樣寬度/mm；h為試樣厚度/mm；D為試樣斷裂時的標距/mm；L為試樣測量初始標距/mm。

1.3.2.3 水蒸氣透過量

膜的水蒸氣透過量的測定參照GB/T 1037—1988《塑料薄膜和片材透水蒸氣性試驗方法 杯式法》[21]，將提前烘干的無水CaCl2放入量杯中，表面鋪平至杯口3 mm位置。將可食膜樣品水平緊密固定于杯口，稱質量后將量杯放入恒溫恒濕箱中（38 ℃、相對濕度90%），每隔一定時間稱量量杯的質量。每個樣品平行測3 組，水蒸氣透過量按公式（3）計算。

式中：Δm為t時間內試樣增加的質量/g；A為樣品透水蒸氣的面積/m2；t為質量增量穩定后的2 次時間間隔/h。

1.3.2.4 透光率

參照GB/T 2410—2008《透明塑料透光率和霧度的測定》[22]分光光度計法測定透光率，采用紫外-可見分光光度計測定可食膜的透光率。將可食膜剪成合適的大小，放置在比色皿內，使入射光束垂直通過樣品，在560 nm波長處讀取透光率。以不放置樣品時透光率為100%作為對照，每個樣品平行測3 組，取平均值。

1.3.3 可食膜制備單因素試驗

取適量乳清分離蛋白、竹葉抗氧化物、酪蛋白酸鈉，按1.3.1節步驟制備可食膜。考察成膜材料質量比、pH值、甘油質量濃度等因素對可食膜性能指標的影響。根據預實驗結果設計因素水平（表1）。對某一因素進行考察時，其他因素均選取水平3的參數進行試驗。所有實驗均重復3 次，取平均值。

表1 單因素試驗因素水平Table 1 Factors and their coded and actual levels used for single factor experiments

1.3.4 可食膜傅里葉變換紅外光譜分析

采用Nicolet iS-50傅里葉變換紅外光譜儀測定可食膜的紅外吸收光譜，光譜范圍525～4 000 cm-1，掃描次數32，分辨率4.000 cm-1。

1.3.5 可食膜SEM觀察

采用SEM觀察可食膜的表面和截面形貌。利用導電膠帶將適量可食膜樣品黏至樣品臺，用離子濺射儀在樣品表面鍍厚度10 nm的金膜，然后放入顯微鏡腔室中進行掃描。可食膜的表面形貌和截面形貌分別在放大1 000 倍和500 倍條件下觀察。

1.3.6 可食膜的保鮮實驗

以未經消毒滅菌處理的魷魚干樣品為試樣，進行可食膜對實際樣品的保鮮實驗。

不添加竹葉抗氧化物，其他條件選擇制備ASWF的最優水平，制備乳清蛋白膜，比較乳清分離蛋白膜與ASWF對魷魚干的保鮮效果。以未經滅菌處理的魷魚干為試樣，對照組直接用普通聚乙烯（polyethylene，PE）膜進行包裝，實驗組分別用乳清分離蛋白膜和ASWF進行內包裝后再用普通PE膜進行包裝。包裝好的樣品于室溫（（25±2）℃）下存放7 d后，從與包裝袋直接接觸的魷魚干表層取樣檢測菌落總數和過氧化值，每組設置3 個平行，取平均值。菌落總數、過氧化值的測定分別參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[23]、GB 5009.227—2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》[24]。

1.4 數據處理與分析

所有實驗數據采用SAS 9.1軟件進行統計分析，顯著性分析采用Duncan’s法，采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 可食膜的厚度

膜材料的厚度會影響其機械強度和阻隔性。在可食膜的制備過程中，對其厚度影響較大的因素是成膜材料的質量比[25]。如表2所示，隨著成膜材料質量比的變化，膜的厚度沒有明顯的變化規律，在0.056～0.064 mm之間，且各厚度之間沒有顯著差異（P＞0.05）。Mostafavi等[26]研究表明，成膜過程中每單位平板面積的薄膜溶液干質量是保持不變的。因此可推測，在薄膜性能指標的測定分析中，任何差異都不是由于厚度不同造成的。

表2 成膜材料質量比對可食膜厚度的影響Table 2 Effect of film-forming material composition on thickness of edible films

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 成膜材料質量比的影響

表3為成膜材料質量比對可食膜斷裂拉伸強度、斷裂伸長率、水蒸氣透過量和透光率的影響。隨著竹葉抗氧化物含量的增加，斷裂拉伸強度呈先增大后減小的趨勢。當m（竹葉抗氧化物）∶m（酪蛋白酸鈉）∶m（乳清分離蛋白）為1∶1∶10時，斷裂拉伸強度達到最大值（17.10 MPa）。這是因為在加熱條件下，乳清分離蛋白和酪蛋白酸鈉兩者的蛋白分子變性，分子內部的部分二硫鍵、巰基和疏水基團暴露出來，在干燥過程中，蛋白鏈間發生更強烈的反應，形成分子間的交聯網狀結構[27-28]。而竹葉抗氧化物的小顆粒有效分布在乳清分離蛋白/酪蛋白酸鈉大分子網狀結構中，形成了更加致密的分子結構，導致斷裂拉伸強度增大。而繼續增多的竹葉抗氧化物可能會發生團聚現象，使其在乳清分離蛋白/酪蛋白酸鈉網狀結構中分布不均，一定程度上破壞了可食膜均勻致密的結構，因此斷裂拉伸強度出現下降現象。同時，竹葉抗氧化物中含有的小顆粒物質會帶來一定的分子內作用力，減小了膜的拉伸柔韌性，因此斷裂伸長率下降。

隨著竹葉抗氧化物比例的增加，膜的水蒸氣透過量呈減小趨勢。這是因為竹葉抗氧化物中黃酮、酚酸、內酯等活性物質的小尺寸效應一定程度增加了可食膜的比表面積，其含有的—OH基團暴露出來，與乳清分離蛋白形成氫鍵，使水分子通過膜的路徑更為曲折。同時，黃酮、酚酸、內酯等小分子的加入使薄膜的透光率整體呈緩慢下降趨勢。隋思瑤等[29]在乳清蛋白膜中添加山梨醇，薄膜的透濕性和透光率也出現下降的現象。

綜合考慮復合膜的斷裂拉伸強度、斷裂伸長率、水蒸氣透過量、透光率等，選擇成膜材料質量比m（竹葉抗氧化物）∶m（酪蛋白酸鈉）∶m（乳清分離蛋白）＝1∶1∶10較為合適。

表3 成膜材料質量比對可食膜性能的影響Table 3 Effect of film-forming material composition on performance of edible films

2.2.2 pH值的影響

圖2 pH值對可食膜性能的影響Fig.2 Effect of film-forming solution pH on performance of edible films

圖2 為p H 值對可食膜斷裂拉伸強度、斷裂伸長率、水蒸氣透過量和透光率的影響。隨著pH值的增大，可食膜的斷裂拉伸強度、斷裂伸長率呈先增大后減小趨勢，pH值為8～9時，斷裂拉伸強度和斷裂伸長率較高。分析原因可能為酪蛋白酸鈉在堿性條件下乳化能力較強，乳清分離蛋白在pH值達到9時黏度大幅增加[30]。因此在pH 8～9范圍內，乳清分離蛋白/酪蛋白酸鈉分子結構融合性好，也促進了竹葉抗氧化物在乳清分離蛋白/酪蛋白酸鈉分子結構中的分布，導致膜的結構致密，所以斷裂拉伸強度、斷裂伸長率增大。而當pH值繼續增大，蛋白分子開始發生堿水解，膜結構被破壞，因此斷裂拉伸強度和斷裂伸長率均出現下降[31-32]。同理，可食膜的水蒸氣透過量在pH值為8～9時較低，此時膜的結構較為致密，阻礙水蒸氣的通過。pH 6～10范圍內，膜的透光率呈緩慢上升趨勢，整體變化不明顯。

綜合考慮復合膜的斷裂拉伸強度、斷裂伸長率、水蒸氣透過量、透光率等，選擇pH值為8～9較為合適。

2.2.3 甘油質量濃度的影響

圖3 甘油質量濃度對可食膜性能的影響Fig.3 Effect of glycerol concentration on performance of edible films

圖3為甘油質量濃度對可食膜斷裂拉伸強度、斷裂伸長率、水蒸氣透過量和透光率的影響。隨著甘油質量濃度由0.02 g/mL上升至0.06 g/mL，膜的斷裂拉伸強度由21.0 MPa下降至16.1 MPa，而膜的斷裂伸長率由26.5%上升至37.4%。這是因為添加甘油后，甘油進入到膜的大分子鏈間，破壞原來的分子結構，使分子間作用力減弱，所以斷裂拉伸強度減小。此外，甘油能增加膜溶液中的黏稠度，增強分子鏈流動性，使制得的復合膜柔韌性更強，所以斷裂伸長率增大[33]。隨著含油量的增大，復合膜的機械阻力減弱，拉伸性能增強，該結果與Galus等[34]的研究結果一致。

膜的水蒸氣透過量隨著甘油質量濃度的增加呈先減小后增大的趨勢。甘油作為增塑劑，含有親水基團，具有較強極性。甘油的加入可與成膜大分子間形成氫鍵等化學鍵，一定程度上阻礙了水分子的通過，因此水蒸氣透過量呈現下降的趨勢。而當甘油的用量繼續增加，其與成膜大分子間形成的氫鍵鍵合力已經大于各分子內的氫鍵鍵合力，導致膜的分子結構中產生空隙[35]。同時甘油會在膜的表面吸附水蒸氣，加快水蒸氣通過膜的擴張速率，從而提高膜的水蒸氣透過性能[36]。李帥等[37]在大豆分離蛋白可食膜工藝優化中也發現隨著甘油質量濃度的增加，可食膜透濕性呈先減小后增大的趨勢。隨著甘油質量濃度的增加，薄膜透光率逐漸增大。食品包裝材料具備較低的透濕率和透光率，有利于阻止水分和光照對食品品質的損壞。

綜合考慮復合膜的斷裂拉伸強度、斷裂伸長率、水蒸氣透過量、透光率等，選擇甘油質量濃度為0.04 g/mL較為合適。在此條件下，制備的ASWF斷裂拉伸強度和斷裂伸長率分別為18.4 MPa、32.8%，水蒸氣透過量和透光率分別為10.86 g/（m2·d）、90.2%。

2.3 可食膜傅里葉變換紅外光譜分析結果

圖4為成膜材料（乳清分離蛋白）和可食膜ASWF在波數525～4 000 cm-1處的傅里葉變換紅外光譜圖。其中乳清分離蛋白的特征吸收峰主要有3 277 cm-1附近出現的N—H伸縮振動峰、2 927 cm-1和2 853 cm-1附近的C—H鍵伸縮振動峰。1 635 cm-1附近為酰胺I帶C—O伸縮振動峰，1 526 cm-1和1 389 cm-1附近分別為酰胺II帶N—H彎曲振動吸收峰和酰胺III帶N—H變形峰及C—N伸縮振動峰。竹葉抗氧化物的特征吸收峰主要有3 264 cm-1附近的酚羥基吸收峰、2 981 cm-1和2 885 cm-1附近的飽和C—H伸縮振動特征吸收峰；羰基的伸縮振動區域在1 900～1 500 cm-1，1 680 cm-1和1 604 cm-1附近為黃酮羰基吸收峰；1 442 cm-1附近為苯環骨架振動峰，885 cm-1附近為C—H的彎曲振動吸收峰。這些吸收峰與前人研究所得黃酮類化合物吸收峰[38-39]一致。

將ASWF的吸收峰與乳清分離蛋白和竹葉抗氧化物的吸收峰對比，發現ASWF在乳清分離蛋白的基礎上增加了1 442 cm-1附近的苯環骨架振動峰、885 cm-1附近C—H的彎曲振動峰，均為竹葉黃酮的特征峰。同時，其酰胺I帶、酰胺II帶和酰胺III帶的吸收峰出現位置分別在波數1 617、1 511 cm-1和1 405 cm-1處。和乳清分離蛋白相比，ASWF的酰胺I帶和酰胺II帶向低波數方向移動，酰胺III帶向高波數方向移動，說明在成膜過程中，各組分間形成了新的共價鍵或者氫鍵，使ASWF分子整體結構發生了一些變化，宏觀上表現為ASWF具有良好的抗拉強度，微觀上表現為ASWF內部結構乳化致密。

圖4 可食膜傅里葉變換紅外光譜圖Fig.4 FTIR spectra of edible films

2.4 可食膜SEM圖觀察結果

圖5 為最優工藝條件制備得到的乳清分離蛋白和ASWF表面和截面的SEM圖，可清晰地觀察到可食膜體系內部結合情況。通過觀察可知，乳清分離蛋白膜表面形貌平整光滑、成膜均勻；ASWF表面比較平整，大部分區域成膜均勻，小部分區域分布有顆粒狀物質團聚。古麗巴哈爾·卡吾力等[40]在對枸杞黃酮的研究中發現，SEM比例尺100 μm條件下觀察到枸杞黃酮存在聚集態，因此推測圖5A2中10 μm比例尺下觀察到的ASWF中顆粒狀物質可能為竹葉提取物中黃酮等小分子的聚集物。圖5B1和圖5B2中膜的截面形貌均呈網狀結構分布，無分層現象。但乳清分離蛋白膜中有少許孔洞出現，ASWF呈現出更為致密的結構。這說明加入竹葉抗氧化物后，成膜液中蛋白分子與黃酮、酚酸等小分子物質分散更加均勻，相容性更好，分子間各基團發生相互作用，產生較強的吸引力，促進了各分子間的交聯。類似研究發現，多酚化合物與大豆蛋白之間的相互作用導致蛋白膜鏈間空間減少，結構更緊密[41-42]。

圖5 乳清分離蛋白和ASWF SEM圖Fig.5 SEM images of WPI and ASWF edible films

2.5 可食膜對魷魚干的保鮮效果

魷魚干營養豐富，適合微生物生存，脂肪含量較高、容易氧化，商品價值易受到影響。表4為各組魷魚干在室溫下貯藏7 d后菌落總數和過氧化值的測定結果。經檢驗，魷魚干樣品的初始菌落總數為7.53×104CFU/g，初始過氧化值為0.216%。存放7 d后，普通PE膜和乳清分離蛋白膜包裝的魷魚干菌落總數分別為3.12×105、2.86×105CFU/g，過氧化值分別為0.285%、0.276%。A S W F 包裝的魷魚干菌落總數和過氧化值分別為7.84×104CFU/g、0.224%。可見，乳清分離蛋白膜對抑制魷魚干微生物繁殖和脂肪氧化有一定的效果，而添加竹葉抗氧化物后制得的ASWF對魷魚干貯藏保鮮有更明顯的作用。有研究表明，竹葉提取物中的黃酮類物質[43]、酚類物質[44]具有良好的抑菌效果，因此ASWF能夠抑制魷魚干中微生物增長。同時，竹葉抗氧化物中含有的黃酮、多酚、多糖等活性物質具有抗氧化作用，能夠抑制魷魚干脂肪氧化。樓鼎鼎等[45]的研究也表明，添加竹葉抗氧化物提高了中式香腸的抗氧化性能。

表4 貯藏7 d可食膜對魷魚干的保鮮效果Table 4 Effect of edible films on preservation of dried squid after preservation of 7-day

3 結 論

通過單因素試驗考察可食膜的性能指標，得到ASWF的最佳制備條件：成膜材料m（竹葉抗氧化物）∶m（酪蛋白酸鈉）∶m（乳清分離蛋白）為1∶1∶10，pH值為8～9，甘油質量濃度為0.04 g/mL。在此條件下，得到的可食膜斷裂拉伸強度和斷裂伸長率分別達18.4 MPa和32.8%，水蒸氣透過量為10.86 g/（m2·d），透光率為90.2%，具備良好的物理性能。傅里葉變換紅外光譜和SEM表征結果顯示成膜材料之間具有良好的相容性。保鮮實驗結果表明，貯存7 d后，ASWF包裝的魷魚干菌落總數和過氧化值分別為7.84×104CFU/g、0.224%，明顯低于普通PE膜（3.12×105CFU/g、0.285%）。添加竹葉抗氧化物提高了可食膜對魷魚干的保鮮效果，ASWF具備良好的微生物抑制作用和抗氧化作用。

本實驗以竹葉抗氧化物、酪蛋白酸鈉和乳清分離蛋白為原材料制備可食膜，拓寬了竹葉抗氧化物的應用范圍，在可降解保鮮包裝領域有較好的應用前景。