外源24-表油菜素內酯調控仔姜活性氧及酚類代謝減輕冷害

游玉明，湯 潔，張美霞，王大平，陸紅佳

（1.經濟植物生物技術重慶市重點實驗室，重慶 402160；2.重慶文理學院園林與生命科學學院，重慶 402160）

生姜（Zingiber officinaleRoscoe）富含精油、姜辣素及維生素等營養物質，是世界范圍內廣泛食用的蔬菜和調味料之一。新鮮仔姜因姜香濃郁、脆嫩爽口、辛辣適宜而受到了消費者的青睞。然而仔姜外皮幼嫩、水分含量高、纖維素含量低，且采收后葉鞘及莖基部分受到機械損傷，常溫貯藏5～7 d即發生失水萎蔫，受微生物浸染出現腐爛，從而失去商品價值[1-2]。低溫能有效緩解仔姜的采后腐爛和變質，但其對低溫敏感，當貯藏溫度低于10 ℃時，即出現水漬狀斑塊，并發生硬度降低及褐變等冷害癥狀[3-4]，限制了低溫貯藏技術在仔姜保鮮中的應用。因此，研究減輕仔姜冷害發生的控制措施對延長其保鮮期具有重要意義。

24-表油菜素內酯（24-epibrassionolide，EBR）是一種重要的甾醇類植物激素，具有高效安全的生物效應，不僅在植物的生長發育中發揮重要作用，且能提高植物在低溫、鹽、干旱及微生物浸染等生物或非生物脅迫下的抗逆性[5]。因此，EBR在果蔬采后病害的防控方面也有廣泛的應用。EBR處理可提高獼猴桃[6]、蜜橘[7]、西蘭花[8]等的貯藏品質和耐貯性，并通過提高抗病相關酶活性，增強葡萄的抗病性[9]。在果蔬采后冷害防控方面，Gao Hui等研究發現茄和桃果實分別采用10 μmol/L和15 μmol/L EBR浸泡10 min后，可顯著抑制冷害的發生，維持細胞功能的完整性，抑制多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）及過氧化物酶等酚類代謝相關酶的活性，保持較高的酚類物質含量[10-11]。外源EBR處理也能通過調節杏果實的活性氧代謝（表現為?、H2O2的積累減少，保持較高的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）等活性氧代謝相關酶活性）從而顯著降低果實冷害發病率和冷害指數[12]。Li Taotao等[13]研究則表明，40 μmol/L EBR處理可以增強香蕉果實的防御能力，促進能量的合成和利用，并通過促進蛋白質生物合成和抑制蛋白質降解來維持蛋白質功能，從而提高果實的耐冷性。但外源EBR處理對仔姜冷害的防控效果及可能機制還鮮見報道。本實驗以鮮食生姜品種‘竹根姜’為實驗材料，研究外源EBR處理對仔姜冷害的防控效果，并從活性氧及酚類代謝方面探討其可能的作用機制，以期為外源EBR在仔姜保鮮中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮‘竹根姜’采自重慶市永川區五間鎮生姜種植基地。選取成熟度一致、大小均勻、無病蟲害的根莖作為供試材料。

EBR（純度＞90%） 上海源葉生物科技有限公司；沒食子酸標準品 美國Sigma公司；福林-酚北京索萊寶科技有限公司；茚三酮、磺基水楊酸、三氯乙酸、硫代巴比妥酸 國藥集團化學試劑有限公司；其他均為國產分析純試劑。

1.2 儀器與設備

752分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；S p e c t r a M a x M 4 酶標儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；TA.XT plus質構儀 英國Stable Micro Systems公司；CM-5色差計 日本柯尼卡美能達公司；BS224S電子分析天平 德國賽多利斯公司；FE38電導率儀 梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；3-18K冷凍離心機 德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

挑選好的‘竹根姜’根莖采用體積分數1%的次氯酸鈉溶液消毒2 min，再以自來水洗凈，室溫自然瀝干。將清洗消毒后的仔姜隨機分成4 組，分別采用0（對照）、5、10 μmol/L及20 μmol/L的EBR溶液浸泡30 min，取出自然晾干后裝入厚0.03 mm的聚乙烯袋，每袋5 個，置于4 ℃、相對濕度85%～90%的冷庫中貯藏25 d。每個處理80 個仔姜，重復3 次。每5 d取10 個樣品測定冷害指數，篩選出對仔姜冷害抑制的最佳濃度。

在篩選出最佳濃度的基礎上，將仔姜隨機分為對照組和處理組，按上述方法進行浸泡處理，貯藏25 d。每5 d定時取樣測定相對電導率、丙二醛含量等變化。同時取仔姜根莖中部立即用液氮速凍，置于-80 ℃冰箱中，用于測定相關酶活力。

1.3.2 冷害指數的測定

冷害指數的測定參考Hao Jiashi等[14]的方法，并略作修改。根據仔姜根莖水漬狀斑塊面積大小分級：1級，無冷害發生；2級，冷害面積比例≤25%；3級，冷害面積比例25%～50%；4級，冷害面積比例50%～80%；5級，冷害面積比例≥80%。冷害指數按公式（1）計算。

1.3.3 硬度及色澤的測定

選取仔姜根莖中部，將其制備成均勻的姜塊，采用質構儀測定其硬度，選用直徑為5 mm探頭，刺入速率為1.8 mm/s，壓縮比為50%[15]。

色澤測定采用Chen Aiqiang等[16]的方法。選仔姜根莖中部附近表皮，測定其貯藏前的色澤（L0*、a0*、b0*值）和貯藏后的色澤（L*、a*、b*值），并按式（2）計算色差ΔE。

1.3.4 相對電導率及丙二醛含量的測定

相對電導率的測定參考凌晨等[17]的方法。用直徑為10 mm的打孔器取樣，稱取厚約3 mm的薄片2 g，用濾紙吸出多余水分后放入具塞刻度試管中，加入20 mL去離子水，在室溫下放置30 min，測電導率（κ1/（μS/cm））。然后煮沸15 min，冷卻至室溫后測電導率（κ2/（μS/cm））。相對電導率按公式（3）計算。

丙二醛含量的測定采用硫代巴比妥酸法[18]，分別測定上清液在450、532 nm和600 nm波長處的吸光度，含量單位為μmol/g，結果以鮮質量計。

1.3.5 H2O2含量的測定

H2O2含量的測定采用硫酸鈦法[11]。稱取5 g混勻后的樣品，經預冷的丙酮充分研磨，在4 ℃、5 000×g條件下離心15 min，取上清液1 mL，加入0.1 mL 5 g/100 mL的硫酸鈦和0.2 mL濃氨水反應后，再在4 ℃、5 000×g條件下離心10 min，沉淀經丙酮洗滌，最后在沉淀中加入3 mL 2 mol/L的濃硫酸溶液，于410 nm波長處測定其吸光度，單位為μmol/g，結果以鮮質量表示。

1.3.6 總酚含量的測定

總酚含量的測定參照高林等[19]的方法，具體采用Folin-Ciocalteu比色法。取2 g樣品，加入6 mL無水甲醇，超聲波提取，在4 ℃、10 000×g條件下離心10 min，取上清液定容至10 mL。取上述提取液0.4 mL，加入體積分數10%的Folin-Ciocalteu試劑2 mL，避光反應1 h，再加入1.8 mL 7.5 g/100 mL Na2CO3溶液，避光反應15 min，于765 nm波長處測定吸光度。結果以每克鮮樣中含有的沒食子酸質量表示，單位為mg/g。

1.3.7 相關酶活力的測定

SOD、CAT及APX活力測定采用曹建康等[20]的方法，并略作修改。稱取5 g仔姜組織，加入5 mL預冷的50 mmol/L的磷酸鈉緩沖液（pH 7.8，含1 mmol/L乙二胺四乙酸、5 g/100 mL聚乙烯吡咯烷酮），冰浴研磨勻漿后，于4 ℃、12 000×g離心30 min，收集上清液用于SOD、CAT和APX活力測定。SOD活力采用氮藍四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）光化還原法，以每克鮮組織抑制NBT光還原反應50%為一個酶活力單位（U）；CAT和APX活力分別以每克鮮組織每分鐘在240 nm和290 nm波長處吸光度變化0.01為一個酶活力單位（U）。

PPO和苯丙氨酸解氨酶（phenylalamine ammonia lyase，PAL）活力測定參考Kavitha等[21]的方法。分別以每克鮮組織每分鐘在420 nm和290 nm處吸光度增加0.01為一個PPO和PAL活力單位（U）。

以上酶活力單位均為U/（g·min）

1.4 數據處理與分析

采用SPSS 21.0軟件進行數據處理，通過Duncan’s法進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著；利用Origin 8.1軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 EBR處理濃度的篩選結果

如圖1A所示，各處理組仔姜的冷害指數隨著冷藏時間的延長而不斷增加，其冷害癥狀表現出時間累積效應，但不同濃度EBR處理對冷藏仔姜冷害指數的影響不同。其中采用10 μmol/L EBR處理的仔姜在整個冷藏期的同一監測點，其冷害指數均低于其他組。在冷藏至第5天時，仔姜表皮出現水漬狀凹陷及黃褐色小斑點，并隨著貯藏時間的延長逐漸擴大，冷藏15 d后，5、10 μmol/L和20 μmol/L EBR處理組仔姜的冷害指數分別為15.6%、9.4%和21.3%，對照組仔姜的冷害指數則達到了31.0%，顯著高于各EBR處理組（P＜0.05），到冷藏結束時，各處理組間的表型差異最為明顯（圖1B），對照組仔姜的冷害指數仍顯著高于各EBR處理組（P＜0.05），5、20 μmol/L EBR處理組仔姜的冷害指數分別為57.1%和69.2%，而10 μmol/L EBR處理組仔姜的冷害指數最低，僅為對照組的51.8%，說明EBR處理能顯著緩解仔姜冷藏期間冷害的發生（P＜0.05），延長其保藏期，其處理的適宜處理濃度為10 μmol/L。因此，本實驗選用濃度為10 μmol/L的EBR進一步探討其緩解仔姜冷害的可能機制。

圖1 EBR處理對仔姜冷害的影響Fig.1 Effect of EBR treatment on CI of baby ginger rhizome

2.2 EBR處理對仔姜硬度及色澤的影響

由圖2A可知，隨著冷藏時間的延長，處理組和對照組硬度不斷降低，冷藏至第10天時，兩者之間出現顯著差異（P＜0.05），10 d后處理組的硬度均極顯著高于對照組（P＜0.01），冷藏至25 d時，處理組硬度比對照組高38.6%。表明EBR處理可有效減緩仔姜冷藏期間硬度的下降，防止仔姜組織軟化。

從圖2B可看出，總色差ΔE隨著冷藏時間的延長而不斷增加，冷藏前10 d其上升速率較慢，而后快速增加。其中EBR處理組ΔE變化較小，冷藏至25 d時，僅為對照組的48.1%，兩者之間達到了極顯著差異（P＜0.01）。說明EBR處理能有效抑制仔姜冷藏過程中色澤的變化，從而較好地保持了仔姜色澤。

圖2 EBR處理對仔姜硬度（A）及色澤（B）的影響Fig.2 Effect of EBR treatment on firmness (A) and color (B) of baby ginger rhizome

2.3 EBR處理對仔姜活性氧及酚類代謝的影響

2.3.1 EBR處理對仔姜相對電導率及丙二醛含量的影響

圖3 EBR處理對仔姜相對電導率（A）及丙二醛含量（B）的影響Fig.3 Effect of EBR treatment on relative electric conductivity (A)and MDA content (B) in baby ginger rhizome

由圖3A、B可以看出，在仔姜冷藏期間，相對電導率和丙二醛含量隨著冷藏時間的延長而總體呈現上升趨勢。EBR處理有效抑制了仔姜相對電導率及丙二醛含量的上升，冷藏至第10天時，EBR處理組丙二醛含量極顯著低于對照組（P＜0.01），冷藏至25 d時，EBR處理組相對電導率及丙二醛含量分別比對照組低24.6%和10.5%（P＜0.05）。說明EBR處理能保護仔姜冷藏期間細胞膜的完整性，減輕低溫脅迫對細胞膜的損傷，抑制膜脂過氧化產物丙二醛的積累。

2.3.2 EBR處理對仔姜H2O2含量及SOD、CAT、APX活力的影響

圖4 EBR處理對仔姜H2O2含量（A）及SOD（B）、CAT（C）、APX（D）活力的影響Fig.4 Effect of EBR treatment on H2O2 content (A), SOD (B), CAT (C)and APX (D) activity in baby ginger rhizome

由圖4A可知，仔姜在冷藏期間，H2O2含量不斷增加。在整個冷藏過程中，EBR處理組H2O2含量始終低于對照組，冷藏至第25天時，EBR處理組H2O2含量比對照組低24.8%（P＜0.01）。

由圖4B可知，仔姜在冷藏過程中，對照組和EBR處理組SOD活力均呈現上升趨勢，但EBR處理組上升速率高于對照組，除冷藏第5、15天外，EBR處理組SOD活力均顯著高于對照組，冷藏至25 d時，EBR處理組SOD活力為2.90 U/（g·min），比對照組高9.0%（P＜0.01）?？梢?，EBR處理提高了冷藏期間仔姜的SOD活力。

由圖4C可知，仔姜在冷藏過程中，其CAT活力呈現先上升后下降的趨勢，對照組仔姜的CAT活力在冷藏至5 d時出現了峰值（56.73 U/（g·min）），隨后開始下降，在冷藏至25 d時，CAT活力下降至28.11 U/（g·min）；EBR處理組也在冷藏至5 d時達到峰值（63.11 U/（g·min）），其峰值比對照組仔姜高11.2%，冷藏至25 d時，其CAT活力為38.14 U/（g·min），比對照組高35.7%（P＜0.01）。說明EBR處理減緩了仔姜冷藏期間CAT活力的下降。

由圖4D可見，仔姜在冷藏過程中，其APX活力的變化趨勢與CAT活力的變化趨勢基本一致。但在冷藏至第10天時，EBR處理組和對照組的APX活力均達到峰值，其中對照組為76.92 U/（g·min），EBR處理組為82.15 U/（g·min），比對照組高6.8%，隨后開始下降，冷藏至25 d時，EBR處理組APX活力為61.72 U/（g·min），比對照組高33.2%（P＜0.01）。說明EBR處理提高了仔姜冷藏期間APX的活力。

2.3.3 EBR處理對仔姜總酚含量及PAL、PPO活力的影響

圖5 EBR處理對仔姜總酚含量（A）和PAL（B）、PPO（C）活力的影響Fig.5 Effect of EBR treatment on total phenol content (A), and PAL (B)and PPO (C) activity in baby ginger rhizome

由圖5A可知，仔姜在冷藏過程中，總酚含量呈先升高后降低的趨勢，且在冷藏至第5天時EBR處理組和對照組均出現峰值，其中對照組總酚含量為0.20 mg/g，EBR處理組則為0.23 mg/g，比對照組高15.0%，冷藏至25 d時，EBR處理組總酚含量為0.18 mg/g，比對照組高38.5%（P＜0.01），與對照組第10天時總酚含量相當。由此可見，EBR處理可以維持仔姜冷藏過程中較高的酚類物質含量。

由圖5B可知，仔姜冷藏期間，對照組及EBR處理組PAL活力總體呈現上升趨勢。與對照組相比，EBR處理提高了仔姜PAL的活力，冷藏至25 d時，EBR處理組PAL的活力為55.47 U/（g·min），比對照組高24.8%（P＜0.01）。說明EBR處理可有效激活PAL活力，促進酚類物質的合成。

由圖5C可知，仔姜冷藏期間，其PPO活力的變化趨勢與PAL活力的變化趨勢基本一致。但EBR處理抑制了仔姜PPO的活力，尤其是在冷藏后期，兩者之間達到極顯著差異（P＜0.01），冷藏至25 d時，EBR處理組PPO活力為3.01 U/（g·min），比對照組低17.3%（P＜0.01）?？梢?，EBR處理可明顯抑制PPO活力，緩解酚類物質氧化。

2.4 相關性分析結果

表1 仔姜冷害指數與主要生理品質指標間的皮爾遜相關性分析Table 1 Pearson correlation analysis between CI and main physiological indicators of baby ginger rhizome

從表1可以看出，冷害指數與相對電導率、丙二醛含量和H2O2含量、SOD活力呈極顯著正相關（r分別為0.890、0.788、0.958、0.787，P＜0.01），與CAT和APX活力呈顯著負相關（P＜0.05），說明隨著冷害癥狀的發生，仔姜細胞膜的完整性被破壞，膜通透性增加，膜脂過氧化物丙二醛、H2O2的積累增多，從而激發SOD活力的增加，但會引起CAT和APX活力的降低。冷害指數與總酚含量呈負相關，但兩者間的相關性不顯著（P＞0.05），這可能是隨著冷害的發生，植物組織產生防御反應，激發了PAL活力的上升，促進了酚類的合成，但細胞間區室化被破壞，PPO游離出來，導致了酚類物質的大量消耗，從而引起褐變，表現為ΔE與冷害指數之間呈極顯著正相關（P＜0.01）。

3 討 論

仔姜在低溫下極易發生冷害現象，隨著冷害的發生，其色澤和硬度產生相應變化，表現為冷害指數與硬度呈極顯著負相關（r＝-0.897），而與ΔE呈極顯著正相關（r＝0.918），這嚴重影響了其貨架期和品質。本實驗結果表明，外源EBR處理緩解了仔姜冷害的發生，顯著降低了仔姜的冷害指數，保持了良好的色澤及硬度，其中以10 μmol/L EBR處理效果最為明顯。

研究表明，活性氧代謝失衡是導致植物在低溫脅迫下發生冷害的主要原因之一[22-23]。在正常狀態下，植物細胞內活性氧的生成和清除處于動態平衡，當植物受到低溫脅迫時，這種平衡遭到破壞，導致大量活性氧自由基產生，使機體處于氧化應激狀態，進而啟動細胞膜的脂質過氧化作用，破壞細胞膜的完整性，使過氧化產物丙二醛積累，電解質外滲，最終導致果蔬品質劣變[24]。本實驗結果也表明，隨著冷害的產生，仔姜H2O2及丙二醛的含量不斷增加，細胞膜透性增強，相對電導率逐漸上升，三者與冷害指數之間均表現為極顯著正相關。因此，通過適當的采后處理調節果蔬在低溫脅迫下的活性氧代謝失衡，是提高果蔬抗冷性、延長其貨架期的有效手段之一。研究表明，多種外源化學成分或物理方式處理可通過調節果蔬活性氧代謝來達到延長果蔬貨架期的目的。如赤霉素[25]和精氨酸[26]等化學保鮮劑可分別通過抑制香椿和石榴冷藏過程中丙二醛及H2O2含量的上升，減少膜脂過氧化作用，增強其抗冷性，減輕冷害癥狀。冷激及熱處理等物理方式也可通過改善冷藏過程中茄子[27]、哈密瓜[28]等活性氧代謝紊亂，從而減輕果蔬的冷害。Yao Yaming等[29]研究表明，黃花菜經0.5 mg/L EBR處理可顯著減少?和H2O2的積累，維持細胞膜的完整性，從而延緩其衰老進程，保持較好的貯藏品質。本研究也發現，采用EBR處理顯著降低了仔姜在冷藏過程丙二醛及H2O2的含量，抑制其細胞內電解質的外滲，保持了細胞的完整性。為清除產生的過量活性氧自由基，植物體內擁有復雜而完善的抗氧化防御系統，其中SOD、CAT及APX等主要酶類在活性氧清除系統中發揮了重要作用，SOD可催化?歧化生產H2O2，生成的H2O2再被CAT、APX分解成無毒的H2O和O2，它們之間的相互協同以減輕活性氧自由基對細胞膜的傷害，從而抑制活性氧自由基誘導的氧化應激[30]。本研究發現，冷害誘導了仔姜SOD、CAT及APX活力的改變，其冷害指數與SOD、CAT及APX活力均顯著相關，而EBR處理有效提高了仔姜SOD、CAT及APX活力。Wang Xiaolu等[6]研究也表明，EBR處理可通過上調獼猴桃SOD及APX等抗氧化酶活力，減小氧化損傷。以上結果說明，激活仔姜活性氧代謝相關酶活力，減少機體活力氧自由基的積累，可能是EBR提高其耐冷力的潛在機理之一。

酚類物質作為植物體內的重要次生代謝產物，它不僅是植物體內重要的非酶抗氧化劑，還是酶促褐變反應的必要底物。很多冷敏性果蔬在低溫脅迫下都伴隨著酚類物質含量的增加，而適當的采后處理可以通過積累更多的酚類物質，減小氧化損傷，從而緩解果蔬冷害癥狀[31-32]。酚類物質的代謝與PAL和PPO等酶密切相關，PAL是酚類生物合成的關鍵酶和限速酶，可催化苯丙氨酸脫氨轉化成肉桂酸；PPO作為植物體內廣泛存在的酶類，在有氧的情況下將酚類物質催化轉變成紅褐色，再與氨基酸縮合生成黑褐色物質[33]。正常狀態下，酚類物質與這些酶的區域化分布抑制了酶促褐變，但在低溫脅迫下植物細胞膜透性增加，細胞區域化逐漸喪失，使得酚類物質與酶接觸，最終導致酚類物質的減少，組織褐變[34]。本實驗研究顯示，冷害導致了仔姜PAL和PPO活力的上升，表現為冷害指數與PAL和PPO活力呈極顯著正相關，而EBR處理后仔姜PAL活力增加，促進了酚類物質的合成；同時，顯著抑制了PPO的活力，減少了酚類物質的消耗。說明EBR可通過調節酚類物質代謝相關酶類，保持較高的酚類物質含量，從而減輕仔姜冷害癥狀。但Gao Hui等[35]研究則表明，EBR處理抑制了藕片PAL的活性，其對酚類物質的累積則主要通過抑制PPO的活性實現，這可能與樣品及貯藏方式的不同有關[35]。

綜上所述，10 μmol/L的外源EBR處理能有效緩解仔姜低溫貯藏期間的冷害發生，并抑制了H2O2和丙二醛的積累，維持膜結構的完整性，其機制可能與調節活性氧和酚類代謝相關酶活性、維持較強的抗氧化能力，進而減輕氧化損傷有關。