5-HT2A受體對七氟醚或丙泊酚麻醉聯合Aβ1-40誘導的大鼠術后認知障礙的影響*

希爾娜衣·艾孜買提，楊 龍，馬海平

（新疆醫科大第一附屬醫院麻醉科，烏魯木齊 830054）

心臟手術患者術后較易出現中樞神經系統并發癥[1-2]，最常見的就是術后認知功能障礙（postoper‐ative cognitive dysfunction,POCD）。POCD 表現為術后記憶力減退、注意力不集中和定向能力低等，其發病機制目前尚未闡明[3]。七氟醚（sevoflurane,Sevo）和丙泊酚（propofol,PRO）是臨床上應用較為廣泛的全麻藥物，其中Sevo在臨床上是用于誘導麻醉的吸入型麻醉藥[4]，PRO 是靜脈麻醉藥物。研究表明，七氟烷和PRO 均會對大鼠認知造成一定的損傷[5-6]。目前認為，誘發POCD 的主要原因為麻醉藥的使用，包括Sevo用于麻醉的誘導和維持危重患者的鎮靜等[4]。PRO可改變海馬Tau蛋白磷酸化水平，而導致POCD 的發生[5-6]。五羥色胺（5-hydroxytryp‐tamine,serotonin,5-HT）是一種有效的神經保護劑，研究表明，5-HT 受體在認知的調控中發揮重要作用[7]。但5-HT2A 受體激動劑對改善認知功能障礙的作用仍不清楚。本研究旨在探討5-HT2A 受體激動劑[1-(2,5-dimethyl-4-iodophenyl) -2-aminopro‐pane,DOI]對Sevo 和PRO聯合Aβ1-40誘導的大鼠POCD的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物與主要試劑 Sevo（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，國藥準字H20040772）；PRO（四川蜀樂藥業股份有限公司，批號0405027）；DOI（美國sigma 公司）。戊巴比妥鈉（美國sigma 公司）。原位細胞死亡檢測試劑盒（德國羅氏診斷有限公司）；山羊血清（北京陽光生物科技）；兔抗鼠5-HT2A 受體一抗和山羊抗兔IgG H&L（美國Abcam公司）。

1.2 實驗動物 4 個月齡雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，SPF 級，體重416～477 g，購自新疆醫科大學動物實驗中心，動物生產許可證號：SCXK（新）2019-0003，使用許可證號：SYXK（新）2019-0015。本研究動物實驗均通過新疆醫科大學動物倫理委員會批準。動物飼養于（24±2）℃和40%～70%相對濕度的通風籠中，每24 h 一個明暗循環（06:00～18:00明、18:00～06:00暗），自由攝食和飲水。

1.3 動物分組與處理 將50 只大鼠隨機分為5 組（n=10），即假手術組、Sevo-POCD 組、PRO-POCD組、DOI+Sevo-POCD 組、DOI+PRO-POCD 組。將5組大鼠分別置于相應的恒溫玻璃容器內，并使其保持自主呼吸。（1）假手術組：由進氣孔通入正常空氣（流速為2 L/min），腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg），在海馬區注射2 μL 生理鹽水；（2）Sevo-POCD組：通入流速為1 L/min 的氧氣+1 L/min 空氣+3.4%Sevo 進行麻醉（德爾格Fabius Plus 型麻醉機），隨后海馬區注射2 μL Aβ1-40（5 μg/μL）誘導POCD；（3）PRO-POCD組：由進氣孔通入正常空氣（流速為2 L/min），按100 mg/kg 劑量腹腔注射3 mL PRO 進行麻醉，隨后海馬區注射2 μL Aβ1-40；（4）DOI+Sevo-POCD 組：在Sevo-POCD 組處理基礎上立即一次性靜脈注射0.5 mg/kg 的DOI；（5）DOI+PRO-POCD組：在PRO-POCD 組處理基礎上立即一次性靜脈注射0.5 mg/kg的DOI[8-9]。1次/d，連續5 d。

1.4 Morris 水迷宮實驗評估大鼠認知功能 每組處理完24 h 后，連續進行7 d 的水迷宮測試，其中包括隱藏平臺測試和空間探索測試。（1）隱藏平臺測試：水迷宮以池底圓心為中心等分為4個象限，分別表示為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限。平臺放置于目標現象（第Ⅱ象限）。將大鼠從面對泳池壁從每個象限中放入水中，游泳90 s 以找到隱藏平臺。逃避潛伏期為在池中定位隱藏平臺所需的時間。若在90 s后未找到平臺，則將大鼠定向到平臺，并將分數計為90 s。前4 d用于訓練。排除得分為90 s的大鼠，將第5天的測試得分記錄為動物的空間學習和記憶的得分。（2）空間探索實驗：在隱藏平臺測試結束24 h 后將平臺移開。將大鼠置于與以前相同的水中，記錄其游泳路徑60 s。記錄大鼠在第Ⅱ象限停留時間和穿越平臺的次數。記錄大鼠的軌跡，并使用莫里斯水迷宮視頻分析系統（WMT-100S，Taimeng）進行信息處理。

1.5 神經功能評分[10]在建模后的第3 天，使用Garcia評分法評估實驗動物的神經功能。（1）動物的活動范圍：無移動（0分），乎不能移動（1分），活動范圍少于籠子3 個面（2 分），活動范圍大于等于籠子3 個面（3 分）；（2）四肢動作對稱性：單側不活動（0 分），單側可輕微活動（1 分），單側肢體活動對側有輕微動作（2分），兩側動作對稱（3分）；（3）前肢運動對稱性：單側不能運動（0分），單側僅輕伸（1分），可運動單側稍弱（2分），前肢對稱伸展（3分）；（4）金屬籠中攀爬能力：無動靜（0分），幾乎無攀爬（1分），有攀爬，單側稍弱（2 分），正常攀爬（3 分）；（5）觸摸身體兩側和觸須反應：無（0分），單側無反應（1分），單側反應弱（2分），有對稱的反應（3分）。動物機能正常時最高評分為18 分，其中籠里自由活動5 min、四肢動作對稱性、前肢運動對稱性、金屬籠中攀爬能力、觸摸身體兩側的反應、觸須反應這6 項各得3分。

1.6 蘇木精－伊紅（HE）染色法觀察大鼠海馬組織病理學變化 所有測試完大鼠1 周后以斷頸法處死，分離完整腦組織，并剝離海馬組織，使用福爾馬林固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋，4 μm 連續切片，二甲苯脫蠟；蘇木精染色5 min，PBS洗滌，伊紅染色30 s，梯度酒精脫水，中性膠封片，光學顯微鏡下觀察海馬組織病理變化。

1.7 TUNEL 測定神經元細胞凋亡率 使用原位細胞死亡檢測試劑盒，將石蠟包埋的海馬組織5 μm切片用二甲基苯脫蠟兩次，每次10 min，通過梯度滲透洗脫酒精；置于37 ℃濕潤暗箱中用50 μL TUNEL反應溶液處理60 min。顯微鏡下隨機選取10 個視野，觀察并記錄棕色核的數目。計算海馬CA1 區TU‐NEL陽性核（棕色）的百分比。

1.8 免疫熒光法檢測5-HT2A受體蛋白表達 海馬組織切片置于3%過氧化氫溶液中浸泡15 min，PBS洗滌，檸檬酸鈉溶液進行抗原回收；山羊血清室溫下封閉30 min，棄血清，加入5-HT2A 受體抗體（1∶100），4 ℃冰箱孵育過夜；PBS 洗滌，山羊抗兔IgG H＆L 抗體（Cy3，1∶200）室溫下孵育30 min，PBS洗滌；添加DAPI染料10 min，PBS洗滌，中性樹膠密封，熒光顯微鏡下觀察。使用Image J軟件分析光吸收值。

1.9 統計學方法 采用SPSS 19.0 軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，隨后進行多重比較檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠認知功能情況 與假手術組比較，Sevo-POCD 組和PRO-POCD 組逃避潛伏期延長，在第Ⅱ象限停留時間縮短，穿越平臺次數減少（均P＜0.05），Sevo-POCD 組與PRO-POCD 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；DOI+Sevo-POCD 組逃避潛伏期短于Sevo-POCD 組，在第Ⅱ象限停留時間長于Sevo-POCD 組，穿越平臺次數多于Sevo-POCD 組（均P＜0.05）；DOI+PRO-POCD 組逃避潛伏期短于PRO-POCD 組，在第Ⅱ象限停留時間長于PROPOCD 組，穿越平臺次數多于PRO-POCD 組（均P＜0.05），見表1。

表1 5組大鼠認知能力比較 ±s

表1 5組大鼠認知能力比較 ±s

與假手術組比較，aP＜0.05；與Sevo-POCD 組比較，bP＜0.05；與PRO-POCD組比較，cP＜0.05。

2.2 神經功能評分 與假手術組[（16.00±0.00）分]比較，Sevo-POCD 組[（2.46±0.56）分]和PRO-POCD組[（3.18±0.42）分]Garcia 神經功能評分降低（P＜0.01），而Sevo-POCD 組與PRO-POCD 組比較，差異無 統 計 學 意 義（P＞0.05）；DOI+Sevo-POCD 組[（9.23±0.80）分]Garcia神經功能評分高于Sevo-POCD組（P＜0.05），DOI+PRO-POCD 組[（7.96±0.57）分]Garcia 神經功能評分高于PRO-POCD 組（P＜0.05）。

2.3 大鼠海馬組織結構變化 假手術組中，海馬CA1 區神經元排列規則、緊密，具有清晰的細胞邊界，且細胞形態規則，細胞核大而圓，細胞質豐富；其余4 組的海馬區神經元細胞嚴重受損，細胞排列疏松紊亂，細胞間隙增大，細胞數目減少，細胞質減少，細胞核固縮嚴重，且細胞形態不規則，見圖1。

2.4 大鼠海馬組織凋亡情況 與假手術組比較，Sevo-POCD 組和PRO-POCD 組神經元細胞凋亡率升高（P＜0.05），PRO-POCD 組與Sevo-POCD 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；DOI+Sevo-POCD組神經元細胞凋亡率低于Sevo-POCD 組（P＜0.05），DOI+PRO-POCD 組神經元細胞凋亡率低于PRO-POCD組（P＜0.05），見圖2。

2.5 大鼠5-HT2A 受體蛋白表達 與假手術組比較，Sevo-POCD 組和PRO-POCD 組的5-HT2A 受體蛋白表達下調（P＜0.01）；另外，DOI+Sevo-POCD 組的5-HT2A 受體蛋白表達高于Sevo-POCD 組（P＜0.05）；且DOI+PRO-POCD組的5-HT2A受體蛋白表達高于PRO-POCD組（P＜0.05），見圖3。

圖1 大鼠海馬CA1區組織HE染色（比例尺=50 μm，×400）

圖2 TUNEL法檢測大鼠海馬CA1區神經元凋亡（×400）

圖3 5-HT2A受體蛋白的熒光染色圖

3 討論

手術后出現中樞神經系統并發癥，表現為精神錯亂、焦慮、人格的改變以及記憶受損，被稱為POCD。大型手術術后往往會表現出的POCD，包括記憶障礙，迷失方向和視覺空間能力，嚴重者可導致患者死亡和致殘[11-12]。麻醉劑的使用已成為POCD 的關鍵因素。POCD 的發病率增加已阻礙了外科手術的發展。臨床上，在Sevo 全麻下，患者的圍手術期出現POCD 的概率明顯增加；而PRO 作為常用的靜脈麻醉藥，起效和蘇醒均較快，術后并發癥出現的概率低，常用于麻醉的誘導和維持及危重患者的鎮靜。

Aβ沉積是各種原因誘發POCD 的共同途徑，亦是POCD 形成和發展的關鍵因素[13]。研究表明，Se‐vo 可能對大鼠認知能力產生一過性影響，在1 周時間點為重要的節點，膽堿能系統發生紊亂，是造成POCD 的關鍵原因[8,14]；而PRO 使海馬Tau 蛋白磷酸化水平發生變化誘導POCD 的發生[15]。本研究在對大鼠進行Sevo 或PRO 麻醉分別聯合大鼠海馬區注射Aβ1-40誘導大鼠發生POCD。通過水迷宮實驗本研究驗證Sevo 麻醉聯合注射Aβ1-40導致大鼠的逃避潛伏期延長，且目標象限（第Ⅱ象限）的停留時間和穿越平臺次數均減少（P＜0.05），而PRO 聯合注射Aβ1-40得到類似的結果。表明Sevo 或PRO 麻醉聯合Aβ沉積均可形成明顯的POCD行為。

5-HT 已經被大量報道在抗抑郁和認知功能障礙中具有關鍵作用，而其5-TH2A 受體的在COPD中的作用則研究較少。盡管如此，仍有研究證實，在患有一般性和局部性腦缺血的動物模型中，5-HT2A 受體可以減輕腦損傷并改善功能恢復[16-17]。5-HT受體激動劑可以明顯改善海馬神經損傷，從而減輕認知功能障礙[18]。早期的報道顯示，5-HT2A受體有益于激活海馬膽堿能神經元[19]，從而可能參與認知功能障礙的調節作用[8,20]。本研究中，大鼠海馬區5-HT2A 受體在Sevo 或PRO 麻醉聯合海馬區注射Aβ1-40誘導POCD 大鼠中的表達明顯下調（P＜0.05）。表明5-HT2A 受體在POCD 發生過程中可能具有關鍵作用。

5-HT2A 受體激動劑處理后大鼠的逃避潛伏期明顯縮短，第Ⅱ象限的停留時間和穿越平臺次數均增加（P＜0.05）。進一步使用Garcia 神經功能評分評估大鼠的神經功能改善情況。Sevo 或PRO 麻醉聯合海馬區注射Aβ1-40誘導誘導下大鼠的神經功能評分明顯降低，籠內活動和攀爬能力，四肢動作對稱性、前肢運動對稱性、觸須反應均表現較差（P＜0.05）。注射5-HT2A 受體激動劑后，大鼠的運動能力、反應能力、左右協調性均明顯改善（P＜0.05）。研究結果表明，5-HT 受體可能是POCD 治療中合適的藥物靶標[21]。除中樞神經組織外，5-HT 受體在大鼠海馬齒狀回、下丘腦、大腦皮層、脊髓中均有表達。另外，由于海馬區神經元的功能是學習和記憶的基礎，POCD 的發生與海馬神經元凋亡有顯著相關性[13]，在本研究中，使用Sevo和PRO 麻醉后，動物的神經元凋亡率明顯升高（P＜0.05），本研究證實，5-HT2A 受體激活可抑制大鼠神經元的凋亡并改善腦損傷，并可能基于此原因從而改善COPD 大鼠的認知功能障礙。

綜上所述，5-HT2A 受體激動劑通過激活5-HT2A受體改善手麻醉劑聯合Aβ1-40誘導的POCD大鼠的認知功能和神經功能紊亂并抑制神經元凋亡。本研究為麻醉劑為關鍵的誘因的POCD治療提供了臨床研究依據。