七氟醚后處理調控cAMP/PKA信號通路減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷的機制研究*

陳 倩，李查兵，康 路

（安徽省第二人民醫院麻醉科，合肥 230041）

心血管疾病是全球發病率和病死率極高的疾病之一[1]。在臨床實踐中，心臟手術引起心肌缺血，導致心臟損害，再灌注期血流恢復后心肌再次受到損傷，這個過程被稱為缺血再灌注（I/R）損傷[2]。心肌I/R 主要發生在心肌梗死、冠心病、腦卒中等心血管疾病患者中[3]。心肌缺血后導致心臟供氧不平衡，進一步導致心臟組織功能障礙。缺血后再灌注會恢復缺血心肌的血流量，這一過程會導致心肌細胞死亡，增加心肌梗死面積[4]。心肌I/R 是導致心血管疾病患者預后生存差的主要原因之一[5]，因此，探究心臟I/R 的發生機制，對提高患者存活率具有重要意義。

七氟醚是目前在臨床上廣泛應用的麻醉劑。近期的研究發現，使用七氟醚預處理后可從一定程度上改善腦損傷，進而起到神經保護作用[6]。有研究表明，七氟醚對線粒體功能具有保護作用，并減輕肝臟損傷[7]。但目前對于七氟醚在心肌I/R 中具體的保護機制尚未深入探究。環磷腺苷（cAMP）/蛋白激酶A（PKA）通路屬于環核苷酸系統，是細胞內經典傳導途徑之一。cAMP 反應元件結合蛋白（cy‐clic-AMP response binding protein，CREB）由341 個氨基酸殘基構成，是富含亮氨酸拉鏈結構的超家族成員。cAMP/PKA 通路活化后可改善I/R 左心室收縮力，進而保護心肌[8]。本研究通過復制I/R 損傷大鼠模型，旨在探究七氟醚在心肌I/R 中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年雄性SD 大鼠80 只，體重250～300 g，SPF 級，由湖南斯萊克景達實驗動物公司提供。動物置于溫度18～26 ℃，相對濕度40%～70%環境中，分籠飼養，以標準飼料及無菌水飼養1 周。本實驗動物處置方法符合安徽省第二人民醫院動物倫理學標準，審批號：201906051。

1.2 實驗分組 將60只大鼠隨機分為5組，每組12只，分別為假手術組（左冠狀動脈前降支穿線，不結扎）、I/R組（結扎左冠狀動脈前降支，缺血30 min，再灌注2 h）、七氟醚后處理（S-post）組（結扎左冠狀動脈前降支，缺血30 min，于缺血末至再灌注開始吸入2.4%七氟醚15 min，再灌注2 h）、H89 組（實驗前24 h 腹腔注射PKA 抑制劑H8920 nmol/mL，后續操作同I/R 組）及S-post+H89 組（實驗前24 h 腹腔注射PKA 抑制劑H89 20 nmol/mL，后續操作同S-post組）。成年大鼠七氟醚的最低肺泡有效濃度（MAC值）為2.4%～2.5%，再參照文獻，本文采用缺血處理后吸入2.4%的七氟醚15 min再灌注2 h作為大鼠模型的建立方法[9]。

1.3 大鼠心肌I/R 模型的建立 所有大鼠術前禁食12 h，自由飲水，腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉大鼠，仰臥固定后，在頸部正中切口，3～4 氣管環切開并插人氣管導管，連接小動物呼吸機行機械通氣，吸入氧濃度33%（呼吸頻率60 次/min，潮氣量5～7 mL/100 g，吸呼比為1∶2，氧流量為1 L/min）。氣管插管后，大鼠右側頸內靜脈及頸內動脈置充滿肝素管，并維持動脈血氣指標。備皮，絡合碘消毒，經左側第5 肋間逐層鈍性分離并打開心包暴露心臟，用7-0 縫合線（山東博達醫療用品股份有限公司）穿過左冠狀動脈前降支，穩定30 min 后結扎，以心外膜發紺蒼白、心電圖提示ST 段抬高，T 波高聳為缺血成功。缺血30 min 后，松開結扎線使左冠狀動脈前降支血流恢復，并持續2 h。當心電圖提示ST 段回落和T 波恢復，心肌組織逐漸轉紅，說明再灌注成功。

1.4 心功能指標檢測 灌注結束時，采用Powerlab/8SP數據采集系統收集左心室發展壓（LVDP）、左心室舒張末期壓（LVEDP）以及最大左心室增加速率（+dp/dtmax）。

1.5 心肌梗死面積測量 再灌注結束后取心臟，去除心房組織，2～3 mm 厚切片，1% 2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC，索萊寶科技有限公司）染色，避光恒溫孵育25 min，PBS 緩沖液洗滌，4%甲醛固定24 h。梗死區被染為灰白色，非梗死區染為磚紅色。拍攝圖像后用Image J軟件計算梗死面積。

1.6 Western blotting 法檢測PKA、CREB、Bax 及Bcl-2 蛋白表達 取大鼠左心室心肌組織，剪碎，加入蛋白裂解液和磷酸酶抑制劑（北京索萊寶），4 ℃下超聲勻漿，離心，收集上清后BCA 法測定蛋白濃度。取30 μg 心肌組織進行SDS-PAGE 分離蛋白，隨后濕法轉到NC 膜，5% BSA（TBST 配制）封閉1.5 h；、磷酸化PKA（p-PKA）兔單抗（1∶1 000，ab2390，英國Abcam 公司）、磷酸化CREB（p-CREB）兔單抗（1∶250，ab32096，英國Abcam公司）、Bax兔單抗（1∶1 000，14796，美國CST 公司）、Bcl-2 鼠單抗（1∶2 000，964495，英國Abcam 公司）、GAPDH 兔單抗（1∶10 000，ab181602，英國Abcam 公司）4 ℃冰箱孵育過夜，TBST 洗膜15 min×3 次；加入相應二抗（1∶2 000～1∶50 000，英國Abcam 公 司），室溫孵育1.5 h，用TBST 洗膜15 min×3 次。ECL 發光、顯色，SmartView Pro 2000（UVCI-2100，美 國Major Sci‐ence 公司）拍照。利用Image J 軟件掃描條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.7 血漿炎癥因子和心肌酶含量檢測 再灌注結束后，采集大鼠尾靜脈血5 mL，置于肝素化抗凝EP管中，分離血漿，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法檢測血漿白介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α 和乳酸脫氫酶（LDH）的含量。IL-1β、TNF-α 試劑盒購于美國R&D 公司，LDH 試劑盒購于南京建成生物研究所，檢測過程嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.8 蘇木精－伊紅（HE）染色 灌注結束后，取大鼠心臟，用無菌生理鹽水沖洗，4%甲醛中固定24 h，酒精脫水后石蠟包埋、切片（4 μm），二甲苯脫蠟，行HE 染色，顯微鏡（上海無陌光學儀器有限公司）下觀察心肌組織的病理變化。

1.9 統計學方法 采用SPSS 20.0 統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料以百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 5 組大鼠心功能指標比較 與假手術組比較，I/R組LVDP及+dp/dtmax降低，LVEDP升高（P＜0.05）；與I/R組比較，S-post 組LVDP 及+dp/dtmax升高，LVEDP降低（P＜0.05）；加入PKA 抑制劑H89后，與S-post 組比較，H89 組及S-post+H89 組LVDP 及+dp/dtmax降低，LVEDP升高（P＜0.05），見表1～表3。

2.2 5 組大鼠心肌梗死面積及LDH 釋放比較 與假手術組比較，I/R 組心肌梗死面積及LHD 釋放量明顯增加（P＜0.05）；與I/R 組比較，S-post 組心肌梗死面積及LHD 釋放量減少（P＜0.05）；與S-post 組比較，H89 組及S-post+H89 組心肌梗死面積及LHD釋放量增加（P＜0.05）；與H89 組比較，S-post+H89組LDH釋放降低（P＜0.05），見圖1、表4。

表1 5組大鼠LVDP比較 kPa，±s

表1 5組大鼠LVDP比較 kPa，±s

與假手術組比較，*P＜0.05；與I/R組比較，#P＜0.05；與S-post比較，@P＜0.05。

表2 5組大鼠LVEDP比較 kPa，±s

表2 5組大鼠LVEDP比較 kPa，±s

與假手術組比較，*P＜0.05；與I/R組比較，#P＜0.05；與S-post比較，@P＜0.05。

表3 5組大鼠+dp/dtmax比較 kPa/s，±s

表3 5組大鼠+dp/dtmax比較 kPa/s，±s

與假手術組比較，*P＜0.05；與I/R組比較，#P＜0.05；與S-post比較，@P＜0.05。

圖1 大鼠TTC染色圖

表4 5組大鼠心肌梗死面積及LDH釋放量比較 ±s

表4 5組大鼠心肌梗死面積及LDH釋放量比較 ±s

與假手術組比較，*P＜0.05；與I/R 組比較，#P＜0.05；與S-post比較，@P＜0.05；與H89組比較，&P＜0.05。

2.3 5組大鼠心肌組織病理學改變 假手術組心肌纖維規則排列，橫紋排列整齊，心肌細胞大小均一，細胞結構完整，形態清晰；I/R 組心肌纖維排列不規則，大部分心肌纖維呈異常波浪狀排列，肌絲斷裂，炎性浸潤明顯，心肌細胞大面積壞死；S-post 組較I/R組細胞形態明顯改善，心肌纖維排列相對規則，細胞炎性浸潤減輕，細胞壞死面積減少；H89 組較Spost 組病理變化更為嚴重，與I/R 組損傷程度類似，出現大量心肌細胞死亡，炎性浸潤明顯；H89+S-post組較H89組稍改善，與I/R組病理變化類似，見圖2。

圖2 大鼠心肌組織HE染色圖（×200）

2.4 5 組大鼠血漿炎癥因子IL-1β 和TNF-α 的含量比較 與假手術組比較，I/R 組IL-1β、TNF-α 含量顯著升高（P＜0.05）；與I/R 組比較，S-post 組IL-1β、TNF-α 含量顯著降低（P＜0.05）；與S-post 組比較，H89 組及S-post+H89 組IL-1β、TNF-α 含量顯著升高（P＜0.05）；與H89 組比較，S-post+H89 組TNF-α 含量顯著降低（P＜0.05），見表5。

表5 5組大鼠血漿炎癥因子IL-1β和TNF-α的含量比較 pg/mL，±s

表5 5組大鼠血漿炎癥因子IL-1β和TNF-α的含量比較 pg/mL，±s

與假手術組比較，*P＜0.05；與I/R 組比較，#P＜0.05；與S-post組比較，@P＜0.05；與H89組比較，&P＜0.05。

2.4 5 組Bcl-2、Bax、p-PKA 及p-CREB 蛋白表達量比較 與假手術組比較，I/R 組Bax 蛋白表達上調，Bcl-2、p-PKA 及p-CREB蛋白表達下調（均P＜0.05）；與I/R 組比較，S-post 組Bax 表達下調，Bcl-2、p-PKA 及p-CREB 表達上調（均P＜0.05）；加入PKA抑制劑H89 后，與S-post 組比較，H89 組及S-post+H89 組Bax 表達上調，Bcl-2、p-PKA 及p-CREB 表達下調（均P＜0.05）；與H89 組比較，S-post+H89 組Bax 表達下調，Bcl-2、p-PKA 及p-CREB 表達上調（均P＜0.05），見圖3。

圖3 Western blotting法檢測心肌組織中Bcl-2、Bax、p-PKA及p-CREB蛋白表達

3 討論

七氟醚作為麻醉藥物，具有術中血流動力學穩定，肌松藥用量小，術后蘇醒快等特點，作為吸入性麻醉劑被廣泛應用于臨床。目前較多研究顯示，七氟醚預處理或后處理能有效抑制心肌I/R 損傷[10-11]。本研究中，S-post 組I/R 大鼠心功能明顯改善，心肌梗死面積和LDH釋放量顯著減少，且血漿炎癥因子水平明顯降低（P＜0.05），進一步說明七氟醚對心肌I/R損傷具有保護作用。

cAMP 是細胞內參與調節物質代謝和生物學功能的重要物質，是生命信息傳遞的“第二信使”。cAMP 在體內可以促進心肌細胞的存活，增強心肌細胞抗損傷，具有抗缺血/缺氧能力；促進鈣離子向心肌細胞內流動，增強磷酸化作用，促進興奮—收縮偶聯，提高心肌細胞收縮力，增加心輸出量；同時擴張外周血管，降低心臟射血阻抗，減輕心臟前、后負荷，增加心排出量，改善心功能，起到營養心肌、正性肌力、舒張血管、抗血小板凝聚和抗心律失常的作用。cAMP 主要通過激活下游PKA 使靶蛋白磷酸化，產生相應的生物學效應。CREB 是細胞內信號通路的交匯點，細胞內信號轉導通路的激活使CREB 的第133 位絲氨酸殘基磷酸化，其活化后調控基因的轉錄。CREB 含量的變化在一定程度上可反映細胞總體信號轉導通路的變化。研究發現，CREB 磷酸化介導的轉錄，能提高海馬神經元的活性和耐受能力，改善腦I/R 損傷[12]。本研究結果顯示，心肌I/R 損傷大鼠中p-PKA、p-CREB 表達較假手術組顯著降低，提示I/R 大鼠心肌組織PKA/CREB 信號通路被抑制；S-post 可明顯上調p-PKA及p-CREB 表達（P＜0.05），而加入PKA 抑制劑H89后，S-post 促進PKA 和CREB 磷酸化的作用被顯著抑制（P＜0.05），提示S-post 對I/R 心肌的保護作用可能與cAMP/PKA/CREB信號通路的活化有關。

心肌I/R 損傷時心肌細胞凋亡加劇，這一現象已被廣泛證實。Bcl-2 和Bax 分別是Bcl-2 家族中最有代表性的抑制凋亡和促進凋亡基因，且Bax 是Bcl-2 活性的主要調控因子。本研究中，I/R 組Bax蛋白表達上調，Bcl-2 蛋白表達下調（P＜0.05），與I/R組比較，S-post組Bax表達下調，Bcl-2表達上調（P＜0.05）；加入PKA 抑制劑H89 后，S-post 對Bax 表達的抑制作用和對Bcl-2 表達的促進作用被顯著逆轉（P＜0.05），推測七氟醚可能通過激活cAMP/PKA/CREB 信號通路抑制心肌細胞凋亡，從而減輕I/R大鼠心肌損傷。

綜上所述，七氟醚后處理可抑制大鼠心肌I/R誘導的心肌細胞凋亡，減少炎癥反應，增加心肌組織內PKA 及CREB 的磷酸化水平，發揮心肌保護作用。而本研究也發現，cAMP 的抑制僅能部分阻斷七氟醚對心肌細胞的保護作用，這提示七氟醚對心肌細胞的保護機制不僅限于cAMP/PKA 信號通路，對此，仍需進行深入探究。