Nano-ZnO-PDA用于抑制齦下菌斑的體外研究*

符國富，韓小東，劉族志，林建能，趙永興

(1.海南省儋州市人民醫(yī)院，儋州 571700；2.解放軍總醫(yī)院海南分院，三亞 572013)

牙菌斑是基質(zhì)包裹的互相黏附、或黏附于牙面、牙間或修復體表面的軟而未礦化的細菌性群體，為不能被水沖去或漱掉的一種細菌性生物膜[1]。牙菌斑主要對牙和牙齦構(gòu)成危害，也就是口腔最常見的兩種疾病：齲病和牙周病。齦上牙菌斑牢固地附著在牙面上，細菌攝入唾液中的糖，分解糖產(chǎn)酸，這些酸會破壞牙齒，最終形成齲洞[2]。齦下牙菌斑中的細菌產(chǎn)生的毒素和其他有害物質(zhì)會刺激牙齦，產(chǎn)生炎癥，即牙齦炎。如不加控制，任其發(fā)展，牙齦炎有可能會發(fā)展為不可逆的牙周炎，引起牙槽骨的破壞，最終導致牙齒松動、脫落[3]。因此，抑制口腔中牙菌斑的形成可以有效預防齲病和牙周病。齦下菌斑中的細菌是以革蘭陰性兼厭氧菌及專性厭氧菌為主，其代表性細菌為牙齦卟啉單胞菌，伴放線聚集桿菌等[4]。

氧化鋅（ZnO）是少數(shù)幾種通過FDA 認證的能在人體內(nèi)應用的無機抗菌材料。同時，ZnO 材料在口腔醫(yī)學領(lǐng)域被廣泛運用，如墊底材料[5]、暫封劑[6]、牙周塞治劑[7]等。納米氧化鋅（nano-ZnO）粒子是粒徑大小約為1～100 nm 的納米顆粒，由于顆粒尺寸的細微化，小尺寸效應和表面效應等使其抗菌性能遠優(yōu)于傳統(tǒng)ZnO材料[8]。nano-ZnO已被證實對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌、真菌、原生動物和病毒均有作用[9]。近年來，細菌引發(fā)的各種疾病患病率不斷升高，一些傳統(tǒng)的口腔抗生素被報道均具有不同程度的耐藥性[10]。nano-ZnO 由于其優(yōu)異的廣譜抗菌性，不產(chǎn)生耐藥性，抗菌效果持久，且生物相容性優(yōu)良，使用方便，在口腔醫(yī)學的應用得到了越來越多的關(guān)注[11]。本研究旨在研究一種nano-ZnO 經(jīng)聚多巴胺（PDA）改性后（nano-ZnO-PDA）對牙齦下菌斑中細菌的抑菌作用，將其可以添加到漱口水或者牙膏中，從而達到預防牙齦炎和牙周炎的目的。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

醋酸鋅、四丁基溴化銨、鹽酸多巴胺（DA）均購買于阿拉丁試劑有限公司；恒溫水浴鍋（B-220,上海亞榮生化儀表廠）；高分辨率透射電鏡（JEM-2000FX Ⅱ，日本電子公司）；超凈工作臺（MINI-V，美國Thermo 公司）；生化恒溫培養(yǎng)箱（DHP-360，北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；厭氧培養(yǎng)箱（HYQX-II，上海躍進醫(yī)療器械公司）；CCK8（同仁，日本）。

1.2 nano-ZnO-PDA的制備

稱取2.75 g醋酸鋅，4.02 g四丁基溴化銨加入到250 mL 的圓底燒瓶中并加入150 mL 的無水乙醇，80 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)攪拌。1 h 后，將0.5g 氫氧化鉀溶于5 mL 的無水乙醇中加入到正在反應的圓底燒瓶中繼續(xù)攪拌，12 h 后取出，甲醇洗滌8 次，將制得的球狀nano-ZnO（nano-ZnO 組），離心，真空冷凍干燥成粉末備用。以pH 值為8.5 的Tris-HCL 緩沖液為溶劑，配制2 g/L 的DA 溶液，將粉末nano-ZnO 浸入到該溶液中24 h 后取出純水洗滌3 次，真空冷凍干燥后得到nano-ZnO-PDA 粉末（nano-ZnO-PDA組）。

1.3 nano-ZnO組和nano-ZnO-PDA組表面形貌

將nano-ZnO 組和nano-ZnO-PDA 組分散到純水中，滴入銅網(wǎng)中，待自然干燥后做透射電鏡觀察其表面形貌，其工作電壓為200 kV。拍攝SAED 衍射圖分析其納米晶體結(jié)構(gòu)特征。

1.4 ZnO 組、nano-ZnO 組、nano-ZnO-PDA 組的體外抗菌性

吸取5 mL滅菌后的LB（肉湯）液體培養(yǎng)基作為溶劑，稱取適量的樣品（ZnO、nano-ZnO 和nano-ZnO-PDA）與其配制成1 000 μg/mL 的樣品懸浮液，超聲30 min 使3 種樣品在培養(yǎng)液里分散均勻，然后放入紫外燈下照射30 min 消毒，備用。金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、牙齦卟啉單胞菌和伴放線聚集桿菌經(jīng)復蘇后穩(wěn)定培養(yǎng)3 d，此時菌落數(shù)量約為1×106CFU/mL（CFU為菌落形成單位）。

1.4.1 對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌的抗菌效果 將金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌細菌懸液充分搖勻后，用移液槍吸取100 μL 細菌懸浮液置于分散好的3種樣品懸浮液中，放置于溫度為37 ℃的恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后將混合液取出搖勻，在超凈工作臺中取100 μL，用PBS 液按1∶10 比例稀釋至一定倍數(shù)，然后吸取100 μL 稀釋后的混合液均勻涂布在LB 瓊脂固體培養(yǎng)基上，生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h（37 ℃有氧條件下）。記錄下每個平板上菌落的數(shù)量，統(tǒng)計數(shù)據(jù)時，根據(jù)稀釋倍數(shù)計算原始的共混液中所含的細菌菌落總數(shù)。公式計算:R=(A-B)/A×100%（其中A 為對照組細菌數(shù)量，B 為實驗組細菌數(shù)量）。每樣本平行檢測3次。

1.4.2 對牙齦卟啉單胞菌、伴放線聚集桿菌的抗菌效果 將牙齦卟啉單胞菌、伴放線聚集桿菌細菌懸液充分搖勻后，用移液槍吸取100 μL 細菌懸浮液置于分散好的3 種樣品懸浮液中，放于溫度為37 ℃的厭氧培養(yǎng)箱（80%N2，10%CO2，10%H2）中培養(yǎng)24 h后將混合液取出搖勻后取100 μL，用PBS 液按1∶10比例稀釋至一定倍數(shù)，然后吸取100 μL 稀釋后的混合液均勻涂布在LB 瓊脂固體培養(yǎng)基上，37 ℃的厭氧培養(yǎng)箱（80%N2，10%CO2，10%H2）中培養(yǎng)24 h。記錄下每個平板上菌落的數(shù)量，統(tǒng)計數(shù)據(jù)時，根據(jù)稀釋倍數(shù)計算原始的共混液中所含的細菌菌落總數(shù)。每樣本平行檢測3次。公式計算:R=(A-B)/A*100%（其中A 為對照組細菌數(shù)量，B 為實驗組細菌數(shù)量）。

1.4.3 3 種ZnO 對離體牙上金黃色葡萄球菌的抑菌效果 取3顆離體牙洗凈后并放置于紫外燈下光照2 h 后滅菌備用，將金黃色葡萄球菌懸液充分搖勻后，用移液槍吸取100 μL 細菌懸浮液置于分散好的3 種樣品懸浮液中，將滅菌后的離體牙置于細菌和樣品混合液中共同培養(yǎng)24 h（37 ℃，有氧），取出各組牙齒用2.5%戊二醛固定，乙醇脫水，噴金后在掃描電鏡下觀察牙齒表面細菌的數(shù)量。

1.5 ZnO 組、nano-ZnO 組、nano-ZnO-PD 組A 的體外細胞毒性

3種樣品紫外殺菌2 h，分別配制成1 000 μg/mL濃度的樣品懸浮液，將人成纖維細胞培養(yǎng)至對數(shù)期，細胞密度為10 000/cm2，100 μL/孔接種樣品懸浮液到96 孔細胞培養(yǎng)板，不加細胞組為空白對照組，細胞培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2）中培養(yǎng)。每隔2 d 換液，用無菌PBS 平衡液洗滌細胞2 次，換用各組樣品懸浮液繼續(xù)培養(yǎng)。向每孔加入10 μL CCK8檢測試劑，在細胞培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2）中孵育6 h，酶標儀測定450 nm處吸光度，每樣本平行檢測3次，并計算細胞存活率（存活率(%)=OD450nm實驗組細胞/OD450nm對照組細胞×100%）。

1.6 ZnO 組、nano-ZnO 組、nano-ZnO-PDA 組在小鼠體內(nèi)組織毒性

通過小鼠灌胃給藥實驗并做組織病理切片檢測3 種材料對小鼠的組織毒性，選6～8 周齡的雄性昆明小鼠9 只，每組3 只，飼養(yǎng)條件保持溫度（22±1）℃、（60±10）%的相對濕度、12 h 的光照和黑暗循環(huán)交替，體重超過25 g 即可達到給藥條件。給藥前一晚禁食，采取灌胃給藥的方式。將準備好的3 種材料置于5 mL 離心管中，采用超純水作為分散劑，配制成濃度為40 mg/mL的懸浮液，超聲分散30 min備用，使用前震蕩搖勻3 min，給藥劑量為每只鼠按照333.33 mg/kg·day-1，連續(xù)灌胃給藥5 d，第6 天將小鼠處死，解剖取出心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟，浸入到4%多聚甲醛固定液中固定。切片用蘇木精－伊紅（HE）進行染色，然后用光學顯微鏡觀察不同樣品對小鼠重要臟器系統(tǒng)的急性組織病理變化。

1.7 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS20.0 統(tǒng)計軟件處理，計數(shù)資料以頻數(shù)或百分率（%）表示，率的比較采用卡方檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 nano-ZnO 組和nano-ZnO-PDA 組的性狀和微觀形貌

水浴法合成的nano-ZnO 經(jīng)冷凍干燥后為白色粉末狀，經(jīng)PDA 改性凍干后變成黑色，見圖1；透射電鏡和SAED 衍射圖，見圖2。nano-ZnO 的納米直徑在50 nm 左右，球狀，表面光滑，經(jīng)改性后nano-ZnO-PDA 球狀形態(tài)保持穩(wěn)定，納米直徑無明顯變化，表面附有一層有機物質(zhì)包裹。SAED 衍射圖顯示nano-ZnO 組為單晶結(jié)構(gòu)，nano-ZnO-PDA 組為復合結(jié)構(gòu)，表明PDA 已成功載入nano-ZnO 中，使原來的單晶結(jié)構(gòu)的nano-ZnO 變?yōu)榫哂袕秃辖Y(jié)構(gòu)的nano-ZnO-PDA。

圖1 nano-ZnO組和nano-ZnO-PDA組的性狀

圖2 nano-ZnO 組、nano-ZnO-PDA 組的TEM 圖及SAED 衍射圖

2.2 ZnO 組、nano-ZnO 組、nano-ZnO-PDA 組的體外抗菌結(jié)果

選用金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、牙齦卟啉單胞菌和伴放線聚集桿菌4 種菌種作為代表菌，分析不同樣品對4種細菌的抑菌率。對于金黃色葡萄球菌，3組抑菌率均在80%以上，但傳統(tǒng)ZnO 組抑菌率低于nano-ZnO組和nano-ZnO-PDA組（P＜0.05），而nano-ZnO 組和nano-ZnO-PDA 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖3A）。傳統(tǒng)ZnO 組對綠膿桿菌的抑制效果不佳，而nano-ZnO 組和nano-ZnO-PDA組對其抑菌效果明顯增加（P＜0.05）（圖3B），同樣，nano-ZnO 組和nano-ZnO-PDA 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。傳統(tǒng)ZnO 組對于牙齦卟啉單胞菌和伴放線聚集桿菌的抑菌作用一般，nano-ZnO 組和nano-ZnO-PDA 組對其抑菌效果有所增加（圖3C、圖3D）。nano-ZnO 組以及nano-ZnO-PDA 組的抗菌效果優(yōu)于普通ZnO 組（P＜0.01），而nano-ZnO組和nano-ZnO-PDA 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖3 3種ZnO對不同細菌的抑菌率

將金黃色葡萄球菌與離體牙共培養(yǎng)，并加入3鐘不同ZnO一起培養(yǎng)后，取出各組牙齒用2.5%戊二醛固定，乙醇脫水，噴金后在掃描電鏡下觀察牙齒表面細菌的數(shù)量。空白對照組中有大量的細菌黏附在牙齒表面，而傳統(tǒng)ZnO 組細菌數(shù)量減少，nano-ZnO 組和nano-ZnO-PDA 組細菌數(shù)量更少，結(jié)果表明傳統(tǒng)ZnO 對黏附在牙齒表面的金黃色葡萄球菌有一定的抑菌作用，但抑菌效果低于nano-ZnO 和nano-ZnO-PDA，見圖4。

2.3 ZnO 組、nano-ZnO 組、nano-ZnO-PDA 組的體外細胞毒性

CCK8 法測定各樣品的在450 nm 的吸光度（OD）值，并得出各組的細胞生存率，見圖5。與ZnO 組比較，nano-ZnO 組在第1、第3、第7 天對人成纖維細胞表現(xiàn)出一定的毒性，經(jīng)PDA 改性后，毒性有所降低（P＜0.05）。

2.4 ZnO 組、nano-ZnO 組、nano-ZnO-PDA 組的體內(nèi)組織毒性

通過小鼠灌胃實驗并解剖其心肝脾肺腎做HE染色結(jié)果，見圖6。各器官并未表現(xiàn)出明顯的炎癥和病理損害，說明3 種ZnO 經(jīng)口腔途徑進入小鼠體內(nèi)短時間內(nèi)并不會對小鼠的重要臟器產(chǎn)生明顯的毒性作用。

圖4 各組對牙齒表面金黃色葡萄球菌的抑菌效果

圖5 3種ZnO第1、4、7天對人成纖維細胞的毒性

圖6 3種ZnO的組織毒性（100×）

3 討論

齦下菌斑中的細菌是導致牙齦炎，牙周炎的始動因素，控制菌斑是預防和控制牙周疾病的重要措施[12]。常規(guī)的刷牙并不能完全去除齦下細菌和菌斑，借助口腔抗菌劑是一種良好的菌斑控制方法。現(xiàn)今口腔抗菌劑有各種劑型，牙膏為最常見劑型之一。常見口腔抗菌劑包括氯己定、甲硝唑等[13]，而抗生素帶來的不良后果主要是導致細菌耐藥性，本研究采用nano-ZnO無機抗菌劑來作為口腔抗菌劑，不僅避免產(chǎn)生耐藥性，而且抗菌效果更是優(yōu)于口腔傳統(tǒng)ZnO 材料，經(jīng)過改性后，其細胞毒性也大大的降低，未來，nano-ZnO-PDA 有望作為口腔常用抗菌劑在人體得到廣泛的應用。

本研究是通過水浴法合成直徑為50nm 左右的nano-ZnO，可以均勻的分散在純水中，nano-ZnO 以及nano-ZnO-PDA 的抗菌效果優(yōu)于普通ZnO（P＜0.05），這是由于nano-ZnO 顆粒尺寸的細微化，小尺寸效應和表面效應等使其抗菌性能遠優(yōu)于傳統(tǒng)ZnO 材料[14]。對于牙齦卟啉單胞菌和伴放線聚集桿菌，nano-ZnO與nano-ZnO-PDA比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。該實驗表明，PDA 作為該nano-ZnO 的表面改性劑，不會影響其抗菌性能。然而，納米材料由于本身顆粒尺寸小，容易進入細胞內(nèi)部而造成毒性增加的缺點，有研究表明，PDA 可以黏附在各類有機物和無機物的表面，不僅能夠保護基底免受微環(huán)境的影響，形成穩(wěn)定的屏障，而且能夠?qū)讓崿F(xiàn)功能化修飾，可控地改變基底性質(zhì)，已被廣泛應用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，如腫瘤治療和藥物傳輸?shù)萚15]。PDA 具有良好的生物相容性，容易形成穩(wěn)定的屏障，有效的降低材料本身的毒副作用[16]，這為本研究選用PDA 作為nano-ZnO 的改性劑以降低納米材料本身的毒性提供了理論依據(jù)。本研究利用DA 在弱堿性的條件下可以發(fā)生氧化自聚作用的特點，在nano-ZnO 表面鍵合形成PDA 層，PDA 層為材料表面的進一步功能化提供反應位點，從而達到材料改性的目的。經(jīng)改性后形成的nano-ZnO-PDA 大大降低了納米材料本身的細胞毒性，這與Scog‐namiglio 等[16]在一項用于外科手術(shù)的經(jīng)多巴胺修飾的多聚糖膜的研究中的結(jié)果一致。

Nano-ZnO-PDA 復合納米材料的制備方法簡單，在抗菌性能以及生物相容性上表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢，在未來，有望作為一種新型的納米無機抗菌劑運用在口腔治療和預防保健中，然而，我們對于其抗菌性還有必要的進一步研究，比如該材料對引起牙周疾病的其他致病菌如具核梭桿菌、福賽坦氏菌等是否有同樣的抑菌效果，以及Nano-ZnO-PDA 需做進一步的體外和體內(nèi)實驗來驗證其生物安全性。