不同潮氣量機械通氣對4NQO飼養大鼠的肺損傷研究*

黃金水，陳秋妙，唐亞平，施小彤

（廣西醫科大學口腔醫學院/附屬口腔醫院麻醉科，南寧 530021）

4-硝基喹啉-1-氧化物（4-nitroquino-line-l-ox‐ide，4NQO）是細胞內氧化應激的一個強有力的誘導劑，可能會引起DNA 的變化，研究發現，大鼠經4NQO 飲水法飼養數周至半年，可誘導出舌組織不典型增生及癌變等病理模型[1-2]。而對于口腔疾病需長時間機械通氣的手術而言，手術時間及氣管導管留置時間過長易出現通氣相關性肺損傷（VILI）。經研究發現，肺保護性通氣策略（LPVS）可以降低機械通氣引起的肺組織損傷程度，但對于LPVS 應用于口腔疾病手術報道較少，本課題組前期臨床研究發現，LPVS 可以促進口腔癌手術患者的氧合功能恢復[3]。因此，本研究分析LPVS 對4NQO 飼養的大鼠機械通氣后肺損傷的影響，并觀察大鼠肺泡灌洗液（BALF）內白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和總蛋白的濃度變化，以及肺水含量和病理改變，旨在探討LPVS的相關保護機制。

1 資料與方法

1.1 主要動物與實驗試劑

選用SPF 級SD 大鼠30 只，雄性，4 周齡，90～100 g，購買于廣西醫科大學實驗動物中心，實驗動物合格證號：SCXK 桂2014-0002。本動物試驗經廣西醫科大學實驗動物倫理委員會批準，實驗操作符合動物倫理學要求。4NQO（Meilunbio）；大鼠IL-6酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒、大鼠TNF-α ELISA 試劑盒（CUSABIO）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（Beyotime）；TUNEL檢測試劑盒（Roche）。

1.2 動物模型建立

4NQO 用蒸餾水配成0.5%的水溶液，避光保存于4 ℃冰箱，使用時用自來水配置成0.005%的溶液。30 只大鼠飼養在廣西醫科大學實驗動物中心普通環境，室內溫度22～25 ℃，濕度40%～70%，明暗交替時間12/12 h，提供充足的飼料，0.005%的4NQO水溶液置入避光瓶中，飼養12周。

1.2 動物模型分組及處理

1.2.1 動物模型分組 30 只大鼠，編號后使用SPSS 23.0 生成隨機數字，并隨機均分為3 組：（1）對照組（A組）：進行氣管切開，無機械通氣；（2）常規潮氣量組（B組）：VT=10 mL/kg，RR=50次/min，IE=1∶2；（3）肺保護性通氣組（C 組）：VT=6 mL/kg，RR=50 次/min，PEEP=0.490 kPa，IE=1∶2，采用控制性肺膨脹法（SI）實施RMs，將大鼠的呼氣端導管接上3 通管并連接50 mL 注射器和水封瓶，同時將呼氣末端導管插入水封瓶5 cm，在呼氣末暫停呼吸機，注射器人工給予0.490 kPa 壓力并維持5 s,同樣的方法逐漸給予15 cm H2O、2.45 kPa 的壓力，并各維持5 s，RMs 完成后立即轉為原通氣模式，并于1 h 進行一次SI[4]，每組10只。

1.2.2 處理 實驗前禁食12 h，麻醉方法采用腹腔注射20%烏拉坦按1 g/kg 麻醉大鼠，后固定于仰臥位行氣管切開，靜脈間斷給予羅庫溴銨10 mg/kg 維持肌肉松弛，氣管插管后，連接小動物呼吸機（上海普辛儀器科技有限公司），按不同通氣模式給予機械通氣。麻醉成功后行頸靜脈置管，用于補液，通氣期間以10 mL/kg·h-1的速率輸注生理鹽水補液。吸空氣4 h 后在麻醉狀態下以放血法處死大鼠采集標本。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 組織病理學檢查 立即完整分離大鼠舌組織、肺組織后，用濾紙吸干表面血跡，取右肺下葉和舌組織分別使用4 ℃的多聚甲醛固定，保存48 h 后行石蠟包埋，制作病理切片。

1.3.2 蘇木精－伊紅（HE）及TUNEL 染色 取舌組織和右肺下葉切片分別行HE 染色后，在光學顯微鏡下觀察。右肺下葉行Smith 評分：對氣道上皮細胞損傷、間質性肺水腫、中性粒細胞浸潤、透明膜和肺泡或間質出血進行0～4分半定量分析，每塊切片均評估出5 個分數，總肺損傷評分為5 個分數之和[5]。同時，使用TUNEL 法檢測右肺下葉的肺泡上皮細胞凋亡指數（AI）：選擇3張肺組織切片，按試劑盒步驟進行TUNEL 檢測，細胞核呈棕黃色為凋亡細胞。每張切片隨機選取肺泡區5個完整而不重疊的高倍視野（×400），計算AI（AI=凋亡細胞數/細胞總數×100%），并取平均值。

1.3.3 支氣管BALF中的IL-6和TNF-α的測定 肉眼觀察肺組織大體變化，并于右主支氣管處結扎右肺，左肺使用4 ℃生理鹽水3 mL，反復灌洗3 次，每次回抽2 mL，共6 mL，收集所有BALF 后，4 ℃、2 000 r/min離心10 min，取上清液于?80 ℃冰箱凍存。ELISA 法按試劑盒步驟檢測BALF 中的IL-6和TNF-α水平。

1.3.4 BALF中的總蛋白濃度測定 BCA蛋白濃度試劑盒按步驟測定BALF中的總蛋白濃度測定。

1.3.5 右肺上葉的濕/干重比（W/D）分離右肺上葉，用濾紙吸干血跡稱濕重，隨后在60 ℃烘干箱烘干48 h稱干重，并計算其濕/干重比值（W/D）)。

1.4 統計學方法

所有數據采用SPSS 23.0 統計軟件進行分析，結果以均數±標準差（±s）表示，當方差齊時，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；當方差不齊時，采用非參數秩和檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 舌組織觀察

HE 染色：大鼠飼養12 周以后，舌頭前部可觀察到上皮發育不良，其特征為從基底層延伸至顆粒層的非典型有絲分裂，細胞核/細胞質比率增加、基底細胞破裂，排列紊亂、角化過度，上皮厚度增加；中部出現上皮萎縮，角蛋白層的鋸齒特征消失，隨后基底細胞的正常特征發生變化，表明中度發育不良，見圖1。

2.2 肺組織觀察

2.2.1 病理觀察 肉眼觀下，A 組的肺組織為正常肺組織，表面無損傷，無充血水腫；B 組表面充血水腫，少部分泛白，部分表現為彌漫性出血點；C 組無明顯血性液體滲出，表面無明顯出血點，僅有少量肺組織水腫。光鏡下（HE 染色），A 組肺泡無破裂，肺間質無增厚，肺泡內無明顯炎性細胞浸潤；B組肺泡融合較多，肺間質部分增厚，可見炎性細胞浸潤，紅細胞滲出較多；C組肺泡融合較少，肺間質增厚較少，僅有少量紅細胞滲出，見圖2。

2.2.2 TUNEL 染色 A 組肺組織偶見凋亡細胞，B組的TUNEL 染色陽性細胞最多，C 組肺組織TU‐NEL 染色陽性細胞較B 組的少，可見少量散在凋亡細胞，見圖3。

2.2.3 HE染色后Smith評分及TUNEL法檢測AI 與A組對比，B組和C組的肺組織Smith評分和AI顯著升高（P＜0.05）。與B 組對比，C 組的肺組織Smith評分和AI均下降（P＜0.05），見表1。

2.3 各組BALF中的IL-6、TNF-α含量、總蛋白濃度和W/D值對比

與A 組對比，B 組和C 組大鼠BALF 中TNF-α、IL-6 含量、總蛋白濃度及肺W/D 顯著升高（P＜0.05）。與B 組對比，C 組的BALF 中TNF-α、IL-6 含量、總蛋白濃度及肺W/D 均明顯下降（P＜0.05），見表2。

表1 3組大鼠BALF中肺組織損傷的Smith評分、AI比較 ±s

表1 3組大鼠BALF中肺組織損傷的Smith評分、AI比較 ±s

與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05。

表2 3 組大鼠BALF 中TNF-α、IL-6 含量、總蛋白濃度及肺W/D比較 ±s

表2 3 組大鼠BALF 中TNF-α、IL-6 含量、總蛋白濃度及肺W/D比較 ±s

與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05。

圖1 舌組織病理改變（HE染色×200）

圖2 3組大鼠肺病理改變（HE染色×400）

圖3 3組大鼠肺組織TUNEL染色結果（×400）

3 討論

對于口腔疾病患者手術實施LPVS 的研究尚少，臨床發現，LPVS 可以有效的改善口腔腫瘤患者的術后肺部預后，縮短ICU 住院時間[6]。對于相關動物實驗目前尚未有報道。而LPVS 通常由小潮氣量、適當的PEEP 和定時的肺復張構成。本研究參照一項meta 分析確定LPVS 的小潮氣量為6 mL/kg[7]，PEEP 的取值參考文章取0.490 kPa[8-9]。肺復張策略的實施方法有3種：壓力性控制法（PCV）、SI及PEEP 遞增法（IP），本研究采用的是SI 法，從0.490 kPa、1.47 kPa 到2.45 kPa 給予肺復張可溫和的提高氣道壓力，避免一次性引起肺部的壓力性肺損傷[4]。從舌組織HE染色結果可以看出，4NQO飲水法飼養大鼠12 周后可誘發舌組織病理表現出的輕中度增生和非典型性增生，和Alicia 等[10]的研究結果相似，提示4NQO 可成功誘導出舌組織不典型增生的模型。此外，可能因飼養時間過短，因此尚未發現舌組織癌變。而通過對4NQO飼養后的大鼠進行肺保護性通氣的研究，可以模擬臨床上LPVS 應用于口腔疾病手術長時間機械通氣（4 h）后的肺保護的研究，并提供基礎研究理論支持。

本研究結果發現，常規潮氣量組和肺保護性通氣組大鼠在長時間機械通氣后，BALF 中的TNF-α、IL-6、總蛋白濃度及肺W/D 均比對照組增高，而肺保護性通氣組的各項指標均低于常規潮氣量組（P＜0.05），而TNF-α 和IL-6 均為肺炎相關的重要炎癥因子，主要產生于單核巨噬細胞，在機械通氣后引起相關肺損傷中表達增高[11-12]。因此，提示使用LPVS 可減少炎癥因子的產生，對口腔疾病大鼠需長時間機械通氣后可能可減少肺部炎癥反應的發生。

本研究結果顯示，對照組和肺保護性通氣組的TUNEL染色陽性細胞較少，而常規潮氣量組的肺組織中凋亡細胞增多，主要為肺泡上皮細胞和肺泡巨噬細胞；同時，通過HE 染色結果可見，常規潮氣量組出現肺泡融合，中性粒細胞聚集和肺泡間質增厚和肺泡內少量出血，相對于對照組和肺保護性通氣組的肺組織損傷程度較為嚴重。可認為，LPVS 不激活肺組織細胞凋亡程序，同時，可以減輕炎癥反應。有學者認為，在健康肺組織中，肺泡巨噬細胞可通過釋放NO 保護肺泡Ⅱ型上皮細胞免受凋亡，而常規潮氣量中，肺泡巨噬細胞大量增生及因細胞周期短而大量凋亡，導致肺泡Ⅱ型上皮細胞隨之凋亡，進而導致肺泡表面活性物質合成和釋放障礙，造成肺組織損傷加重[13-14]。

綜上所述，使用LPVS，可以有效的減輕經4NQO 飲水法飼養的大鼠的肺損傷。但因本研究只選擇0.49 kPa EEP 值作為研究的因素，未研究其他水平的PEEP 值，因此，臨床應用時可根據患者自身情況來調節相應的PEEP值。