耐藥性肺結核患者血清IL-22、TNF-α水平與耐多藥免疫機制的相關性*

王永峰，侯永華，王 翔，李 琛

（河北省胸科醫院 1.肺結節三科；2.內分泌科，石家莊 050041）

肺結核（tuberculosis，TB）是世界上感染致病菌后致死率居于首位的傳染病，確診后為防止病情進一步惡化，可以采用抗結核桿菌的治療方法[1]。我國傳染科病房資料顯示，結核桿菌對已治愈過的TB藥物耐藥性日益增強，耐藥性肺結核（drug-resistant pulmonary tuberculosis，DR-TB）發生率逐年增高[2]。DR-TB 病情發展急驟、變化迅速且較兇險，常累及多器官系統，尚無特效療法而直接導致死亡。探索更迅速、有效的治療DR-TB 患者的方法已成為醫學研究熱點，有學者認為DR-TB 治療效果較差原因是未對特異性指標進行細致觀察和及時處理[3]。DRTB的臨床表現是病情的進一步加重，導致患者免疫功能的削弱，從而導致患者病情的延誤。基于DRTB發病機制，大量學者指出增加機體免疫系統可有效治療DR-TB[4]。臨床上目前對較敏感的評估性指標尚不清楚，有研究發現，DR-TB 發生與發展與多種免疫細胞相關，其中報道較多的有Th相關細胞及其因子[5]。另有文獻顯示，血清白介素-22（interleu‐kin-22，IL-22）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis fac‐tor-α，TNF-α）水平增加與DR-TB的發生和發展有一定關系[6]。本研究探討IL-22、TNF-α 在DR-TB 患者中的表達，現將結果報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017 年7 月至2019 年7 月河北省胸科醫院結核內科收治的DR-TB 患者68 例和敏感TB 36例為研究對象，病例納入標準：（1）DR-TB 診斷符合WHO 于2014年推出的《耐藥結核病規劃管理指南》的診斷標準[7]；（2）年齡18～65 歲；（3）近期未使用激素類藥物或免疫調節劑；（4）對本研究治療方法有耐受性；（5）心、肝、腎功能正常；（6）患者住院資料完整，各項輔助檢查均已完成。排除標準：（1）對本研究使用的藥物過敏者；（2）合并其他肺部疾病者；（3）妊娠或哺乳期婦女；（4）嚴重精神疾病或心血管、造血系統，肝、腎等嚴重原發性疾病者；（5）合并肺性腦病、休克，頭暈者；（6）廣泛耐多藥結核病者。本研究已取得醫院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

將DR-TB 患者按治療方法不同分為治療1 組（34 例，單純抗結核治療）和治療2 組（34 例，免疫治療＋單純抗結核治療）。敏感TB 患者為對照組，采用單純抗結核治療。治療1組中，男20例，女14例；平均年齡(58.09±5.87)歲；平均病程(10.02±5.45)年；急性發作平均時間(7.76±4.23)d。治療2 組中，男21 例，女13 例；平均年齡(57.93±6.02)歲；平均病程(10.37±5.22)年；急性發作平均時間(8.02±4.19)d。對照組中，男19 例，女17 例；平均年齡(58.21±6.23)歲；平均病程(11.02±5.57)年；急性發作平均時間(8.13±4.62)d。3組性別、年齡、病程等一般資料比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

3 組治療方案均在WHO 標準化方案基礎上聯合個體化治療。給藥方案：采用莫西沙星、左氧氟沙星、吡嗪酰胺、利福噴丁、阿米卡星、丙硫異煙胺聯合用藥，所用藥物的用法及用量如下：莫西沙星0.4 g/次，1 次/d；左氧氟沙星0.4 g/次，1 次/d；吡嗪酰胺0.75 g，2 次/d；阿米卡星0.5 g，1 次/d；利福噴丁0.45 g/次，2 次/周；丙硫異煙胺0.15 g/次，3 次/d，所有藥物均為口服。DR-TB 標準化療程為痰陰轉換后6個月或至少4個月，共12個月，在治療結束后行免疫調節疫苗分枝桿菌注射液22.5 μg肌注1周。

1.3 觀察指標

1.3.1 影像學圖采集 A 級（顯著）：病變吸收面積大于基底病變面積的1/2；B 級（吸收）：1/5～1/2；C級：小于1/5；D級：病變面積增大。

1.3.2 IL-22 和TNF-α 水平檢測 空腹取靜脈血4 mL，采用LFF-LC-1781 全自動生化分析儀（美國貝克曼生物有限公司）法檢測血清IL-22 和TNF-α水平。

1.3.3 Th細胞亞群CD3+、CD8+、CD4+/CD8+檢測 使用EPICS-ALTRA 流式細胞儀（蘇州生物基因技術有限公司）檢測Th細胞亞群CD3+、CD8+百分比及CD4+/CD8+比值。所用試劑購自邁瑞生物科技有限公司。

1.3.4 臨床療效及不良反應 比較3組臨床有效率和不良反應發生率。（1）DR-TB 有效：治療結束后連續3 次及以上痰培養陰性，咳嗽，咳痰，咯血，胸痛，呼吸困難，盜汗，乏力，食欲降低等臨床癥狀消失，肺部影像學檢查正常；（2）單純性TB 有效：治療結束前1 個月及結束后痰抗酸染色陰性，咳嗽，咳痰，咯血，胸痛，呼吸困難，盜汗，乏力，食欲降低等臨床癥狀消失。記錄治療過程中一過性頭暈、過敏性休克、低血壓發生例數。

1.3.5 結核菌轉陰率（1）痰抗酸染色：患者留取3份痰標本（清晨痰、夜間痰及隨機痰），收集至無菌彭氏杯標本盒內送檢痰涂片抗酸染色。（2）痰結核菌培養：患者留取痰標本收集至無菌痰標本盒內，處理后，將MGIT 培養管置入BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌培養儀孵育培養，其熒光強度記憶探測儀每隔60 min連續測定培養管內熒光強度。

1.3.6 IL-22、TNF-α對T細胞體外刺激誘導實驗 將DR-TB 患者外周血CD4+、CD8+T 細胞純化，使用10%胎牛血清中培養，每孔加2×105個反應細胞且按1∶1、2∶1、4∶1 的細胞比例加入刺激細胞，設置為實驗組，將1 個平行孔中加入等體積PBS 溶液設為空白組；取實驗組和空白組上清液，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法檢測IL-22、TNF-α 水平。試劑盒購自邁瑞生物科技有限公司。

1.4 統計學方法

采用SPSS 23.0 統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料以百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Pearson 相關檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組治療前、后影像圖

治療前，3 組均有結核感染病灶；治療6 個、12個月后，3 組病灶均有吸收，對照組、治療1 組、治療2 組吸收分別達到A 級、D 級和C 級，對照組和治療2 組的吸收率明顯高于治療1 組，但治療2 組與對照組無明顯差別，見圖1。

2.2 3組治療前、后IL-22、TNF-α比較

治療前，治療1 組、治療2 組IL-22、TNF-α 水平均高于對照組（P＜0.05）；治療6 個、12 個月后，3 組IL-22、TNF-α 水平均低于治療前（P＜0.05），對照組和治療2 組IL-22、TNF-α 水平低于治療1 組（P＜0.05），見表1。

2.3 3組免疫功能指標比較

治療前，治療1組、治療2組CD3+T細胞百分比顯著高于對照組，CD4+/CD8+比值低于對照組（均P＜0.05）；治療6個、12個月后，治療2組、對照組各免疫功能指標與治療前比較，差異有統計學意義（P＜0.05），且對照組、治療2 組與治療1 組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

2.4 IL-22、TNF-α與免疫功能指標的相關性分析

圖1 3組治療前、后影像圖

表1 3組治療前、后IL-22和TNF-α水平比較 ng/L，±s

表1 3組治療前、后IL-22和TNF-α水平比較 ng/L，±s

與本組治療前比較，*P＜0.05；與對照組同一時間點比較，&P＜0.05；與治療1組同一時間點比較，#P＜0.05。

表2 3組免疫功能指標比較 ±s

表2 3組免疫功能指標比較 ±s

與本組治療前比較，*P＜0.05；與對照組同一時間點比較，&P＜0.05；與治療1 組同一時間點比較，#P＜0.05。

Pearson相關性分析顯示，IL-22、TNF-α 與CD3+、CD8+、CD4+/CD8+均呈正相關關系（P＜0.05），見圖2。

2.5 3組臨床療效、結核菌轉陰率、不良反應發生率比較

治療12 個月后，對照組和治療2 組臨床有效率和結核菌轉陰率均高于治療1 組（P＜0.05），治療2組與對照組臨床有效率、結核菌轉陰率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；3 組不良反應發生率比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

2.6 IL-22、TNF-α對T細胞體外刺激誘導實驗

加入IL-22、TNF-α 刺激的實驗組CD3+、CD8+下降趨勢較空白組有明顯差異（P＜0.05），見圖3。

圖2 IL-22、TNF-α與免疫功能指標的相關性分析

表3 3組臨床療效、結核菌轉陰率、不良反應率比較 n（%）

圖3 IL-22、TNF-α對T細胞體外刺激誘導實驗圖

3 討論

臨床資料已證實，DR-TB 治療矛盾多，療效不佳[8]。有文獻顯示，TB 產生的高耐藥性與細胞免疫應答障礙密切相關[9]。陳偉偉等[10]指出，一般抗結核治療作為目前DR-TB 常規治療方式不能調控巨噬細胞等免疫細胞基質，肺部情況無明顯改善甚至加重。TB治療后產生高耐藥性發展為DR-TB，而DRTB病情變化更迅速、驟急，免疫機制進一步受損，治療難度增加。沈娟等[11]通過實驗發現，免疫療法可改善CD3+、CD8+，促進病灶吸收。多種因素都會影響其作用機制，鄭伯俊等[12]將大鼠作為研究對象，實驗結果顯示IL-18 作用后的Th22 細胞分泌功能提高，表明機體免疫功能受一些免疫因子影響。綜上考慮對免疫因子在DR-TB 患者中的表達水平及作用，可能對該病更優治療方案作出相關建議。

TB 治療早期，肺部未發生組織學及生物學改變，藥物治療能改善炎癥表現。嚴重的免疫功能障礙會使機體抵抗結核桿菌能力減弱，并產生耐藥性。研究調查顯示DR-TB 發生與T 淋巴細胞亞群有關，CD3+、CD4+/CD8+比值失衡標志著機體免疫功能紊亂[13]。CD3+是成熟T 細胞的表面標志物，鹽橋可以連接T 細胞抗原受體（T cell antigen receptor,TCR），參與T細胞信號轉導。CD4+是一種輔助性T淋巴細胞，其功能是協助免疫球蛋白G（immuno‐globulin,IgG）、IgA 和IgM 的合成。馮麗[14]指出，CD4+可進行抗結核免疫調節，其機制是同時改變T細胞增殖和細胞因子。CD8+主要是細胞毒性T 淋巴細胞，可引CD4+/CD8+失衡，干擾B 淋巴細胞功能，減少體內抗體數量。Th22細胞可通過分泌多種細胞免疫因子發揮免疫抑制作用，Abebe 等[15]的小樣本實驗中指出，通過IL-22、TNF-α 發揮作用的Th22細胞，對免疫具有較強的抑制作用。有研究結果表明通過TNF-α 過量表達有助于抗結核桿菌感染的敏感性增加，這對DR-TB 免疫應答有很好的研究價值。在眾多肺部免疫細胞中IL-22 減少后肺部很難自我修復，這會加重其感染的風險[16]。有研究發現，進行基因敲除觀察IL-22 含量變化，能夠明顯發現Th22細胞產生的免疫機制通路中IL-22的含量發生變化[17]。另外，文玉欣等[18]研究顯示，IL-22 呈高表達水平，機體無法導致其變化敏感性。本研究結果顯示，DR-TB 患者體內血清IL-22、TNF-α 含量增多（P＜0.05），提示IL-22、TNF-α 與該病發生有一定相關性。對DR-TB 患者采取不同治療方法發現免疫調節組免疫功能顯著改善，考慮與結核桿菌吸收更顯著有關。IL-22可激活巨噬細胞，進而對胞內炎性物質進行清除已得到證實，而其與TNF-α 共同作用進一步加強免疫機制[19-20]。為了驗證IL-22、TNF-α 與DR-TB 免疫機制相關性，本研究采用T 細胞體外實驗，在IL-22、TNF-α 能夠使CD3+、CD8+下降趨勢顯著增加，說明IL-22、TNF-α 可提高DR-TB免疫機制。

綜上，IL-22、TNF-α與DR-TB發生、發展密切相關，且對免疫機制起重要作用，該病治療過程中應多關注IL-22、TNF-α 濃度。但由于時間限制、樣本量小，未深入探究產生IL-22 的不同細胞對結果的影響，另外，不同的免疫因子可能存在不同的作用機制，仍需進一步分析。