加味芪黃飲對糖尿病腎病大鼠腎纖維化的影響

周艷利，蒙向欣，李輝遠，何 騁

（1．廣州醫科大學附屬中醫醫院，廣東 廣州 510130；2．廣東省廣州市東升醫院，廣東 廣州 510130）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病較重要的微血管并發癥之一，也是導致終末期腎病的首要原因。近年來，DN發病率越來越高，且治療費用較高，社會的經濟負擔重［1］。腎纖維化是各種慢性腎病進展到終末期腎衰竭的共同通路，也是DN引起腎功能衰竭的主要途徑［2］。DN的形態學改變如細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的過度增生、沉積及腎小球基底膜（glomerular basement membrane，GBM）的增厚等與腎功能降低密切相關。Ⅲ型膠原（Collagen type III，Col-Ⅲ）及Ⅳ型膠原（Collagen type IV，Col-Ⅳ）均屬膠原蛋白，是構成ECM的主要成分［3］。血清中IV、Ⅲ型膠原增高在一定程度上反映體內纖維化情況，被稱為腎纖維化指標［4］。本研究擬通過觀察加味芪黃飲對DN大鼠的治療作用，研究其對Col-Ⅲ、Col-Ⅳ的表達的影響，以期為加味芪黃飲治療DN提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物

3月齡SD大鼠（南方醫科大學實驗動物中心，許可證號：SYXK（粵）2018-0001）60只，雄性，SPF級，體質量（300±25）g。

1.2 藥物及試劑

加味芪黃飲由廣州市中醫醫院中藥制劑室提供。藥用黃芪30g，太子參、生地、山藥、白茅根各20g，澤瀉、茯苓、蟬蛻、溪黃草、女貞子各15g、山茱萸、丹皮各10g。加水500mL，用我院傳統容器煎藥機濃煎45min，用無菌保鮮的真空包裝，1袋150mL，放置冰箱保存，使用時加熱至30℃胃飼。鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，美國Sigma公司生成，批號S0130），碘125胰島素放射免疫分析試劑盒（北京科美東雅公司），HRP標記的羊抗兔IgG（美國CST公司，批號CST #5127）。

1.3 儀器

RM2135型石蠟切片機（德國LEICA公司）；IX71型普通熒光倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；全自動生化分析儀（日本日立公司）；HL-10型循環式無壓力傳統容器煎藥機（韓國和印物業）。

1.4 T2DM腎病大鼠模型復制

SD大鼠適應性喂養1周后，隨機分為正常對照組（15例）和T2DM腎病組（45例）。正常對照組大鼠予普通飼料喂養。T2DM腎病組：大鼠予高糖高脂飲食（66.5%常規飼料+20%蔗糖+10%豬油+2.5%膽固醇+1%膽酸鹽），喂養8周后，禁食24h，空腹狀態下取1%STZ按45mg/kg一次性腹腔注射。1周后，內眥靜脈取血測定大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）水平，當FBG＞7.8mmol/L，表明T2DM模型建立成功。STZ注射后2周，用代謝籠收集兩組大鼠24h尿液，檢測24h尿白蛋白（24h urine albumin，24h UAlb）水平，當24h UAlb＞正常對照組均值3倍時，表明T2DM腎病模型制備成功，結果制備成功的大鼠模型共有39只。

1.5 分組及給藥方法

進一步將T2DM腎病大鼠隨機分為模型對照組、加味芪黃飲低劑量組和高劑量組（以下簡稱低劑量組、高劑量組），每組各13只。低、高劑量組大鼠每日分別予加味芪黃飲400mg/kg、800 mg/kg，正常對照組、模型對照組大鼠則分別予等量生理鹽水。均灌胃給藥12周。

1.6 血及尿生化指標檢測

給藥結束后用代謝籠收集各組大鼠24h尿液行24h UAlb定量，收集大鼠內眥靜脈血測定血肌酐（Serum creatinine，Scr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平。

1.7 腎組織HE染色檢查

給藥結束后檢殺各組大鼠，取一側腎臟置于10%福爾馬林固定后，石蠟包埋備用。用切片機將腎組織制成厚度2μm切片，常規脫蠟后，進行HE染色，光鏡下觀察各組大鼠腎組織病理變化。

1.8 采用免疫組織化學二步法

檢測殘腎組織中Col-Ⅲ及Col-Ⅳ的表達。光鏡下觀察，陽性染色細胞胞漿或胞膜出現黃色或棕黃色顆粒，胞核呈藍色。采用IPP6.0醫學圖像分析系統，每張切片隨機選取5個不含腎小球和小血管的腎皮質400倍視野，測定累積光密度（IOD）值，對Col-Ⅲ及Col-Ⅳ進行圖像分析。

1.9 統計學方法

采用SPSS16.0統計軟件進行數據分析，數據以（±s）表示。組內分析采用成組t檢驗方法。多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時，用方差分析-LSD法，方差不齊時，用校正方差分析法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠24 h UAlb、Scr、BUN、FBG測定

測定各組大鼠血、尿生化指標。與正常對照組相比，模型對照組大鼠24h UAlb、Scr、BUN、FBG水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型對照組比較，加味芪黃飲高、低劑量組大鼠24h UAlb、Scr、BUN、FBG、水平均更低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠24 h UAlb、Scr、BUN、FBG測定 （±s ）

表1 各組大鼠24 h UAlb、Scr、BUN、FBG測定 （±s ）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05；與低劑量示組比較，▲P＜0.05。

組別 鼠數 24 h UAlb/（mg·24 h） Scr/（mmol·L） BUN/（mmol·L） FBG/（mmol·L）正常對照組 15 9.27±2.63 62.31±3.45 6.78±1.54 6.05±0.68模型對照組 13 107.53±11.67* 105.74±7.89* 28.33±3.78* 21.15±1.55*低劑量組 13 84.89±10.54# 90.45±5.67# 23.67±3.37# 17.34±1.98#高劑量組 13 61.67±8.21#▲ 78.74±4.65#▲ 20.11±3.67#▲ 13.43±1.50#▲

2.2 各組大鼠腎組織病理變化

光鏡下觀察各組大鼠腎組織病理改變。正常對照組：腎小球體積正常，系膜細胞、系膜基質未見增生，基底膜無增厚，腎小管形態結構正常。模型對照組：腎小球肥大，腎小球囊腔呈裂隙狀，系膜細胞、系膜基質彌漫增生，毛細血管袢塌陷或閉塞，腎小管管腔狹窄。加味芪黃飲高、低劑量組與模型對照組比較，病理損傷減輕，且隨藥物劑量增大，其損傷恢復程度更趨明顯。

2.3 各組大鼠腎組織膠原蛋白表達變化

Ⅲ型膠原正常僅在于腎間質及腎小管上皮細胞輕度表達，陽性染色為棕黃色。實驗中可見模型組大鼠腎小管間質可見大量Ⅲ型膠原沉積，小片狀分布，著色深，與正常組相比Col-Ⅲ、Col-Ⅳ表達顯著增多，差異有統計學意義（P＜0.01）。加味芪黃飲低劑量組與高劑量組均較模型組表達減少，且差異有統計學意義（P＜0.01）。加味芪黃飲高劑量組與低劑量組比較表達減少，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表2。表明加味芪黃飲可顯著降低腎組織中Col-Ⅲ、Col-Ⅳ的表達，提示加味芪黃飲可能通過減少細胞外基質的沉積，延緩腎纖維化，且與劑量呈正相關。

表2 Col-Ⅲ、Col-Ⅳ平均光密度的定量分析 （±s ）

表2 Col-Ⅲ、Col-Ⅳ平均光密度的定量分析 （±s ）

注：與正常組比較，◆P＜0.05；與模型組比較，★P＜0.05；與低劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 鼠數 Col-Ⅲ平均光密度 Col-Ⅳ平均光密度正常對照組 15 0.3128±0.0016▲ 0.2923±0.0065▲模型對照組 13 0.4002±0.0014◆ 0.3807±0.0016◆低劑量組 13 0.3675±0.0007◆★ 0.3487±0.0015◆★高劑量組 13 0.3302±0.0006◆★▲ 0.3113±0.0007◆★▲

3 討 論

DN早期病理特征為腎小球肥大和GBM增厚以及ECM合成增多，逐步出現腎小球纖維化，最終引起腎功能衰竭［5-6］。腎間質纖維化的病理生理過程主要包括：細胞激活與損傷、形成纖維化的信號傳遞、纖維化形成以及腎臟損害等。過度沉積的纖維組織，包括間質膠原（I型、Ⅲ型、Ⅳ型）、纖維連接素和一些糖蛋白取代了健康的腎單位，導致腎臟原有組織結構的改變，損傷了腎功能，從而導致有效腎單位逐漸消失及相應的腎功能進行性下降，最終病情發展成終末期腎病。大量實驗［7-8］證實，隨著腎間質纖維化程度的加深，Ⅲ型膠原的沉積也隨之增多，表明Ⅲ型膠原促進了小管間質纖維化。Col-IV在腎小管上表達異常增多的程度影響腎臟組織結構病理的改變、腎間質纖維化、腎小管萎縮及炎癥細胞浸潤，Col-IV分布與系膜增生相一致［9］。相關研究表明［10］，Col-Ⅳ與腎纖維化成正相關，故早期抑制腎間質纖維化對延緩DN的進展至關展有重要。

DN屬中醫“消渴”“水腫”“尿濁”等范疇。屬本虛標實之證，以五臟之氣、血、陰、陽虛為本，以痰凝、瘀血、濕濁為標。因此治療應以益腎為本，固其封藏，正其開闔，兼以化痰除濕、活血通絡。本課題組中的加味芪黃飲，由中醫治療消渴虛勞方六味地黃丸、參芪地黃湯等化裁而成。方中黃芪為君藥，益氣固脫，利水消腫，攝血藏精；臣以太子參補中益氣，健脾生津，山茱萸、生地、女貞子、山藥、滋補肝腎健脾，澀精固脫；牡丹皮活血散瘀，澤瀉利水滲濕化濁，茯苓補氣健脾，溪黃草清熱利濕，白茅根、蟬蛻清熱解毒，共為佐使，全方有益腎固精，化瘀清利之功。大量研究表明［11-12］，中藥能從多方面起作用，以減輕腎臟的ECM積聚，防止腎纖維化。中藥不僅能抑制導致腎纖維化的各種細胞因子，降解ECM成分的積聚，而且有些藥物能直接抑制ECM相關組成成分的合成。本研究以加味芪黃飲治療DN大鼠，發現其降低DN大鼠的24 h UAlb、Scr、BUN、FBG水平，推測加味芪黃飲對腎間質纖維化有一定的治療，可能通過下調Col-Ⅲ及Col-Ⅳ在腎間質的表達，抑制細胞外基質的增生、積聚，從而達到保護腎臟、防止腎間質纖維化的作用，延緩病程，且隨劑量增加療效更顯著。

綜上所述，加味芪黃飲治療DN療效確切，其可能通過下調腎組織Col-Ⅲ、Col-Ⅳ的表達，延緩DN進展。