APTT糾正試驗檢測方法的建立及臨床應用

王 賢,夏 茂,夏永泉,沈 瀚

南京大學醫學院附屬南京鼓樓醫院檢驗科，江蘇南京 210007

活化部分凝血活酶時間(APTT)延長是臨床常見的凝血功能障礙，原因主要是凝血因子的缺乏或者凝血抑制物的存在，其中凝血抑制物以抗磷脂抗體、Ⅷ因子抗體最常見。不同原因導致的APTT延長，臨床治療方案不同[1-2]。APTT糾正試驗是分析APTT延長原因的凝血篩查試驗，用于判斷患者是存在凝血因子缺乏還是凝血抑制物，為下一步治療提供信息。APTT糾正試驗操作簡便易行，不需要昂貴的儀器，基層單位也可開展。但是目前APTT糾正試驗沒有標準化[3-4]，國內文獻較少見關于完整的APTT糾正試驗操作方法和解釋規則建立、分析的報道，這影響了APTT糾正試驗的臨床應用。本研究旨在建立完整的APTT糾正試驗的操作方法及解釋規則，探討APTT糾正試驗在鑒別APTT延長原因中的應用價值，推進APTT糾正試驗的標準化和臨床普及。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年1月至12月本院收治的APTT延長、凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)、纖維蛋白原(Fg)正常的患者共115例。其中臨床確診為單純內源凝血因子缺乏(簡稱單純因子缺乏)的患者68例，各種不同類型凝血抑制物陽性患者47例。凝血抑制物陽性患者中，抗磷脂抗體陽性患者29例，包括狼瘡抗凝物(LA)陽性25例，抗心磷脂抗體陽性4例；Ⅷ因子抗體陽性患者18例。所有患者均符合臨床及實驗室診斷標準。本研究所使用的標本均為本實驗室進行凝血試驗后剩余的枸櫞酸鈉抗凝血標本，排除有分析前誤差及行抗凝治療的患者標本。所有標本均進行APTT糾正試驗檢測。

1.2儀器與試劑 日本Sysmex CS-5100全自動凝血分析儀，試劑均為配套產品，包括APTT檢測試劑盒(凝固法)和氯化鈣。

1.3方法

1.3.1制備正常血漿 選取至少20份健康者的血漿混合，要求：APTT結果接近參考范圍(28～32 s)的中間值；避免選擇妊娠婦女的血漿標本。混合后的正常血漿進行凝血因子(Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ)活性和血小板計數的檢測，要求：所有凝血因子水平要接近100%；血漿中血小板計數<10×109/L。制備好的正常血漿分裝后于-70 ℃冷凍保存。

1.3.2即刻試驗 取3支試管(1、2、3號)，依次放入患者血漿、正常血漿、混合血漿(患者血漿與正常血漿1∶1混合)，上機檢測APTT，測得的結果分別標記為A、B、C，計算Rosner指數(RI)=[(A-B)/C]×100%。

1.3.3溫育試驗 即刻試驗完成后，將混合血漿全部放入37 ℃水浴溫育2 h，結束后再取1支試管(4號)，放入溫育后的混合血漿，上機檢測3、4號管的APTT，測得的結果分別標為D、E，計算溫育試驗檢測管D與對照管E之間的差值(溫育差)。

1.4統計學處理 采用SPSS17．0軟件進行統計分析。計量資料呈非正態分布，以M(P25～P75)表示，組間比較采用秩和檢驗(Z檢驗)。采用非參數法構建受試者工作特征曲線(ROC曲線)，確立診斷界值，ROC曲線間的比較采用Z檢驗。計數資料以百分率或頻數表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1建立APTT糾正試驗中即刻試驗RI的診斷界值 凝血抑制物陽性患者的即刻試驗RI[18.7%(6.7%～24.9%)]高于單純因子缺乏患者[3.8%(1.6%～9.8%)]，差異有統計學意義(Z=-8.847,P<0.001)；繪制即刻試驗RI用于凝血抑制物陽性與單純因子缺乏患者鑒別診斷的ROC曲線，曲線下面積(AUC)為0.829(標準差為0.03)，見圖1。抗磷脂抗體患者的即刻試驗RI[21.4%(11.2%～24.9%)]高于單純因子缺乏患者[3.8%(1.6%～9.8%)]，差異有統計學意義(Z=-11.484,P<0.001)；繪制即刻試驗RI用于抗磷脂抗體陽性與單純因子缺乏患者鑒別診斷的ROC曲線，AUC為0.930(標準差為0.02)，見圖2。兩條ROC曲線的AUC比較，差異有統計學意義(Z=2.801，P=0.002)，即刻試驗RI用于鑒別凝血抗磷脂抗體陽性與單純因子缺乏的診斷效能比用于鑒別凝血抗磷脂抗體陽性與單純因子缺乏的診斷效率高。即刻試驗RI用于鑒別抗磷脂抗體與單純因子缺乏患者的最佳診斷界值為11.0%，靈敏度為85.7%，特異度91.2%。

圖1 即刻試驗RI用于鑒別凝血抑制物陽性與單純因子缺乏患者的ROC曲線

圖2 即刻試驗RI用于鑒別抗磷脂抗體陽性與單純因子缺乏患者的ROC曲線

即刻試驗RI用于鑒別診斷的結果分析：68例單純因子缺乏患者中，66例APTT糾正試驗結果顯示為被糾正，糾正率97.1%；18例Ⅷ因子抗體陽性患者中，8例被糾正，糾正率44.4%；29例抗磷脂抗體陽性患者中，5例被糾正，這5例均為低滴度LA陽性患者，LA標準化比值依次為1.2、1.2、1.3、1.5、1.5。單純因子缺乏患者、Ⅷ因子抗體陽性患者、抗磷脂抗體陽性患者的糾正率依次降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2建立APTT糾正試驗中溫育差的診斷界值 Ⅷ因子抗體陽性患者的溫育差[6.5(2.6～19.4)s]與Ⅷ因子抗體陰性患者[0.6(-1.3～2.7)s]相比，明顯升高，差異有統計學意義(Z=-6.803,P<0.001)。繪制APTT糾正試驗中溫育差用于鑒別Ⅷ因子抗體陽性與陰性患者的ROC曲線，AUC為0.927(標準差為0.02)，最佳診斷界值為3 s，靈敏度為85.7%，特異度為89.8%，見圖3。

圖3 溫育差用于鑒別Ⅷ因子抗體陽性與陰性患者的ROC曲線

2.3APTT糾正試驗結果判定規則的建立及應用 根據APTT糾正試驗中即刻RI、溫育差將患者分為3類：單純因子缺乏、非時間依賴性抑制物(本研究中為抗磷脂抗體)陽性、時間依賴性抑制物(本研究中為Ⅷ因子抗體)陽性，見表1。

表1 APTT糾正試驗的結果判定規則

APTT糾正試驗結果判定的正確率為89.6%(103/115)，見表2。單純因子缺乏組中，4例患者判定錯誤；其中2例被誤判為時間依賴性抑制物陽性，溫育差接近診斷界值，分別為3.0、3.3 s；2例被誤判為非時間依賴性抑制物陽性，即刻RI分別為11.2%、11.8%。抗磷脂抗體陽性組中，5例患者被誤判為單純因子缺乏，均為低滴度LA陽性患者；2例被判定為時間依賴性抑制物陽性，溫育差分別為6.1、4.4 s；Ⅷ因子抗體陽性組中，3例患者被誤判為單純因子缺乏，溫育差分別為2.6、2.9、2.9 s，Ⅷ因子抗體滴度分別為0.9、1.2、1.0 BU/mL。

表2 APTT糾正試驗的判定結果分析(n)

3 討 論

臨床引起APTT延長的原因主要有兩大類，一類是凝血因子缺乏，一類是凝血抑制物存在，其中凝血抑制物主要有抗磷脂抗體和凝血因子抗體兩類，根據反應特性又可以分為時間依賴性抑制物和非時間依賴性抑制物[3]，其中時間依賴性抑制物中最常見的是Ⅷ因子抗體，非時間依賴性抑制物最常見的是抗磷脂抗體。APTT延長原因不同患者的臨床治療方案差異很大：(1)凝血因子缺乏容易增加患者的出血風險，治療上需要補充相應的凝血因子、解決凝血因子缺乏的原因；(2)Ⅷ因子抗體會抑制Ⅷ因子的活性，容易引起出血，加重血友病A患者的病情，使其原有治療手段失效[5]；(3)抗磷脂類抗體因為與磷脂結合，會干擾APTT檢測和基于APTT試驗的凝血因子檢測，造成APTT假性延長、凝血因子假性減少，抗磷脂抗體對于臨床而言，更多的是增加血栓發生風險，而不是出血風險[6]。APTT糾正試驗是有助于臨床判定APTT延長原因的篩選試驗，操作簡單、耗時短且易于開展，為治療方案的制訂提供參考。

目前，APTT糾正試驗無論是操作流程還是解釋規則都沒有統一的共識，缺乏標準化，各實驗室間都存在很大的差異，所選取的診斷界值靈敏度和特異度差異也很大[7-10]，限制了APTT糾正試驗的臨床應用，尤其是在基層醫院臨床實驗室。本研究確立了APTT糾正試驗的即刻RI和溫育差的診斷界值，建立了APTT糾正試驗的完整解釋規則，并將其應用于臨床APTT延長原因的篩查。本研究采用建立的APTT糾正試驗方法和解釋規則進行判定，正確率為89.6%，說明本研究建立的APTT糾正試驗方法可以有效地用于臨床APTT延長原因的篩查，為進一步推進APTT糾正試驗的標準化提供了依據。

本研究中，4例被誤判的單純因子缺乏患者，2例的即刻RI，另2例的溫育差均接近診斷界值；被誤判為單純因子缺乏的患者中，5例為低滴度LA陽性患者，即刻RI接近診斷界值，3例為低滴度Ⅷ因子抗體，溫育差接近診斷界值。筆者認為當APTT糾正試驗在即刻RI、溫育差檢測值接近診斷界值時，結果判定的準確性下降，對于低滴度的抗磷脂抗體和低滴度的Ⅷ因子抗體陽性的患者，容易出現假陰性結果，導致漏診。APTT糾正試驗在臨床的應用中，對于這種現象應加以重視[11-13]。

本研究認為，APTT糾正試驗稀釋效應造成了低滴度凝血抑制物檢測的假陰性[2,11]，英國血液學標準委員會指南(BCSH 2012)中指出稀釋效應可導致弱陽性LA檢測結果出現假陰性，即使1∶1混合試驗結果陰性，篩選試驗和確證試驗檢測結果呈陽性時，仍應判定結果為陽性。美國臨床和實驗室標準協會指南(CLSI 2014)則完全更改了LA的檢測流程(篩選試驗-確證試驗-1∶1混合試驗)并指出只有在篩選試驗和確證試驗結果難以解釋時再進行1∶1混合試驗[5]。本研究結果與上述理論一致，APTT糾正試驗對于低滴度LA陽性患者會產生假陰性的結果。

Ⅷ因子抗體有兩種類型，一種是來自于血友病A患者的同型抗體，一種是獲得性血友病患者的自身抗體，它們與Ⅷ因子的免疫反應均為時間依賴性，是一種慢反應性物質，在37 ℃ 2 h才能對Ⅷ因子達到完全的抑制[13]。本研究中的18例Ⅷ因子抗體陽性患者中，僅有10例被APTT糾正試驗中的即刻試驗判定為未被糾正，8例被判斷為被糾正，糾正率達44.4%，這與Ⅷ因子反應特性相符合，說明APTT糾正試驗僅憑即刻試驗無法有效對Ⅷ因子抗體等時間依賴性抑制物陽性和單純因子缺乏進行鑒別[14]。

有文獻報道，有10%～15%的LA也會呈時間、溫度依賴性，因此糾正試驗的溫育試驗并不能完全鑒別Ⅷ因子抗體和抗磷脂抗體陽性的患者[15]。本研究中，2例LA陽性患者被判定為時間依賴性抑制物陽性，溫育差分別為6.1 s和4.4 s，猜測可能是患者體內有部分LA為時間依賴性慢反應抑制物，與文獻[15]報道相符。這提示，單憑APTT糾正試驗無法完全鑒別抗磷脂抗體與Ⅷ因子抗體，必要時需要增加其他實驗室檢測項目來輔助結果的判定。

綜上所述，APTT糾正試驗是臨床判定APTT延長原因，檢測凝血抑制物的重要篩查試驗。建立完整的操作流程和解釋規則是APTT糾正試驗開展的關鍵。臨床在根據APTT糾正試驗的檢測數據進行結果判定時，要充分了解它的優勢和局限性，才能得出準確的結論。