固定化木質(zhì)素降解菌對園林廢棄物堆肥的影響

孟童瑤，李素艷，鄒榮松，余克非，付冰妍，揭 陽

（1. 北京林業(yè)大學 林學院，北京 100083；2. 國家林業(yè)和草原局 鹽堿地研究中心，北京 100091；3. 中國林業(yè)科學研究院 天津林業(yè)科學研究所，天津 300270）

城市園林綠化事業(yè)的快速發(fā)展導致園林廢棄物的數(shù)量日益增多[1]。堆肥已成為園林廢棄物資源化利用的主要方式之一[2?5]。園林廢棄物中的木本植物殘體存在大量難降解的木質(zhì)素。這些木質(zhì)素溶解性差，沒有任何易被水解的鍵，分子結(jié)構復雜且不規(guī)則，含有各種穩(wěn)定的復雜鍵型，微生物及其分泌的酶不易與之結(jié)合[6]。這些木質(zhì)素還包裹著纖維素，即使微生物可分解單獨存在的纖維素，但細胞壁中木質(zhì)素對纖維素起到保護作用，纖維素的降解仍受到限制[7?8]，嚴重影響堆肥進程，因此促進木質(zhì)素降解是加快堆肥進程和提高堆肥產(chǎn)品品質(zhì)的重要環(huán)節(jié)[9]。自然界中的真菌、細菌及相應微生物群落可通過產(chǎn)生分解木質(zhì)素的酶系統(tǒng)(漆酶、錳過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶)將木質(zhì)素完全降解，且大多數(shù)真菌降解效果強于細菌[6,10]。堆肥中添加微生物菌劑可顯著提高木質(zhì)素降解率，加快堆肥進程[8,11]。YU等[12]通過二次回歸正交設計研制出了一種園林廢棄物專用復合菌劑，其木質(zhì)素降解能力強于有效微生物復合菌(EM菌)。何慧中等[13]開發(fā)出一種復合功能菌劑，添加到桉樹Eucalyptus皮堆肥中，木質(zhì)素降解效果顯著，與對照相比木質(zhì)素含量下降了78.78%。目前，有關木質(zhì)素降解的菌劑研究多集中在液體菌劑，但液體菌劑存在生產(chǎn)工序復雜，易污染，易失活，不便于保存等缺點。因此，有必要將木質(zhì)素降解菌制成固體菌劑，彌補液體菌劑的不足。微生物固定化技術是指通過物理或化學的手段將游離的微生物限定在一定的空間區(qū)域，保持其生物活性并能反復利用的方法[14]。將菌株運用固定化方式制成的固體菌劑，具有生產(chǎn)成本低，耐儲存，不易失活，便于運輸?shù)葍?yōu)點，有利于菌劑在更大范圍內(nèi)推廣和應用[15]。然而，固體菌劑的產(chǎn)品質(zhì)量受多種因素影響，如接菌量、保護劑濃度和含水率可直接影響菌劑產(chǎn)品的穩(wěn)定性和應用效果，而且國內(nèi)外關于木質(zhì)素降解菌固定化的研究尚不充分，有關園林廢棄物堆肥的報道更為鮮見。鑒于此，本研究將1株木質(zhì)素降解菌通過固定化的方式制成固體菌劑，以有效活菌數(shù)為評價指標，對菌劑制作過程中的主要影響因素進行優(yōu)化，再通過正交試驗獲得最佳固體菌劑的制備條件，將其應用到園林廢棄物堆肥中進行效果檢驗，以期為該類菌劑的研制與應用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

菌種為曲霉屬Aspergillussp.真菌No.11[1]，目前保存于北京林業(yè)大學林學院土壤生物學實驗室。堆肥原料來源于北京植物園，主要為花草樹木的人工修剪物和自然生長產(chǎn)生的枯枝落葉，粉碎成1～2 cm粒徑。培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基。載體與保護劑：通過預實驗確定生物質(zhì)炭和米糠為固定化載體，海藻糖為保護劑，載體混合質(zhì)量比為1∶1。

1.2 方法

1.2.1 種子液的制備 將4 ℃保存的菌株No.11接種到PDA培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)3 d完成活化。將活化后的菌株No.11挑取至裝有100 mL PDB培養(yǎng)基的搖瓶中，置于28 ℃、200 r·min?1的搖床中培養(yǎng)48 h(對數(shù)生長期末)獲得種子液備用。

1.2.2 單因素優(yōu)化試驗 接菌量試驗：按照載體質(zhì)量的5%、10%、15%、20%和25%接種種子液，調(diào)節(jié)料水質(zhì)量比為1.0∶0.8，攪拌均勻，28 ℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)完成后放在40 ℃烘箱中完全烘干，在室溫下干燥密封保存30 d后，測定有效活菌數(shù)。

保護劑體積分數(shù)試驗：種子液中分別添加體積分數(shù)為0、4%、8%、12%、16%和20%的保護劑，按載體質(zhì)量的10%接種到載體中，調(diào)節(jié)料水質(zhì)量比為1.0∶0.8，混勻后，28 ℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)完成后放在40 ℃烘箱中完全烘干，在室溫下干燥密封保存30 d后，測定有效活菌數(shù)。

含水率試驗：向載體中接種質(zhì)量分數(shù)為10%的種子液，調(diào)節(jié)料水質(zhì)量比為1.0∶0.8，混合均勻，28 ℃培養(yǎng)48 h之后，放在40 ℃烘箱中烘至含水率為5%、10%、15%、20%和25%，在室溫下干燥密封保存30 d后，測定有效活菌數(shù)。

1.2.3 正交試驗設計 根據(jù)1.2.2節(jié)試驗結(jié)果確定優(yōu)化范圍，其中接菌量為5%、10%、15%，保護劑體積分數(shù)為0、4%、8%，含水率為10%、15%、20%，進行3因素3水平正交試驗設計。具體方案見表1。根據(jù)表1，向載體中接種相應水平的種子液和保護劑，調(diào)節(jié)料水質(zhì)量比為1.0∶0.8，混合均勻，28 ℃培養(yǎng)48 h，之后放在40 ℃烘箱中烘至該處理對應的含水率。將制備好的固體菌劑在室溫環(huán)境下干燥密封保存30 d，測定有效活菌數(shù)，確定最佳菌劑的制備條件。

1.2.4 固體菌劑堆肥效果驗證 堆肥模擬試驗。將粉碎后的園林廢棄物分別裝入500 mL錐形瓶，裝80 g·瓶?1，調(diào)節(jié)含水率達60%，共4組處理，分別為不添加菌劑(ck)、添加質(zhì)量分數(shù)為0.5%市售EM菌劑(T1)、添加質(zhì)量分數(shù)為0.5%自制固體菌劑(T2)、添加質(zhì)量分數(shù)為1.0%自制固體菌劑(T3)。各組處理3次重復。攪拌均勻后用8層紗布封好瓶口，置于恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。為模擬堆肥過程中的升溫、高溫和降溫階段，彌補堆肥模擬試驗中因堆體較小，無法自主升溫的缺陷，人工進行培養(yǎng)箱溫度的調(diào)節(jié)：溫度從25 ℃逐漸上升至50 ℃，再逐漸降至30 ℃。各階段經(jīng)歷時間分別為5、30、5 d。

樣品采集。采集第1、8、16、24、32、40 天的堆肥樣品鮮樣1 g，測定木質(zhì)素降解相關酶的酶活力；采集第1 天和第40 天堆肥樣品測定pH、電導率(EC)、D(465)/D(665)[樣品濾液在465 nm處吸光度D(465)和665 nm處吸光度D(665)的比值]、種子發(fā)芽指數(shù)(IG)、木質(zhì)素質(zhì)量分數(shù)和纖維素質(zhì)量分數(shù)等指標。

木質(zhì)素降解相關酶活力測定。漆酶、錳過氧化物酶和木素過氧化物酶活力測定參照田林雙[16]的木質(zhì)素降解相關酶類測定標準方法。

堆肥腐熟指標測定。pH和EC測定：稱取待測樣品5 g，置于100 mL塑料瓶中，加入50 mL蒸餾水，200 r·min?1振蕩1 h，過濾其上清液，用pH 400防水型筆式pH計和EC 400防水型筆式電導率/TDS/鹽度計分別測定各樣品的pH和EC；樣品濾液在465 nm處吸光度D(465)和665 nm處吸光度D(665)測定：用UV-6 100紫外可見分光光度計 (上海元析儀器有限公司)測定樣品濾液在465 nm處吸光度D(465)和665 nm處吸光度D(665)；IG測定：取5 g鮮樣置于100 mL塑料瓶中，加入50 mL蒸餾水，振蕩1 h后獲取上清液，將2張濾紙平鋪到直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，濾紙上加入5 mL上清液，以蒸餾水為空白對照，播撒白菜Brassica chinensis種子20粒·皿?1，置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后記錄發(fā)芽率和根長。計算IG，IG=(上清液處理的發(fā)芽率×根長)/(空白組的發(fā)芽率×根長)×100%。木質(zhì)素、纖維素降解率測定：木質(zhì)素、纖維素質(zhì)量分數(shù)分別用硝酸-乙醇法和72%硫酸法進行測定[17]。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2010 和SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素優(yōu)化試驗結(jié)果

接菌量可直接影響固體菌劑的質(zhì)量。接菌量過少會延長菌株的生長停滯期，過大會增加生產(chǎn)成本，也會增強微生物之間的競爭作用[18]。由圖1A可知：固體菌劑中的有效活菌數(shù)隨接菌量的增加呈先增加后減少的趨勢，接菌量為10%時有效活菌數(shù)最高，達3.73×1010CFU·g?1；其次是接菌量為5%和15%時，有效活菌數(shù)達2.50×1010CFU·g?1以上；當接菌量超過15%時，菌劑中的有效活菌數(shù)逐漸降低，低于2.50×1010CFU·g?1。因此，選用接菌量5%、10%和15%作為正交試驗的3個水平。

微生物菌劑中添加一定量的保護劑可以增強其耐儲藏性和穩(wěn)定性，能直接影響菌劑的產(chǎn)品質(zhì)量與應用效果[19]。由圖1B可看出：當保護劑體積分數(shù)為8%時，活菌數(shù)最高達7.10×1010CFU·g?1，保護劑體積分數(shù)＜8%時，有效活菌數(shù)隨保護劑體積分數(shù)升高而增多；當保護劑體積分數(shù)＞8%后，隨著保護劑體積分數(shù)的升高，有效活菌數(shù)顯著(P＜0.05)降低，低于4.00×1010CFU·g?1。因此，選用0、4%和8%作為正交試驗的3個水平。

含水率對固體菌劑的儲存有很大影響。含水率過高容易滋生雜菌，使固體菌劑受到污染影響應用效果，含水率過低不利于菌株的生存，一段時間后有效活菌數(shù)會大幅度降低[20]。由圖1C可知：隨著含水率的提高，固體菌劑中有效活菌數(shù)呈先升高后降低的趨勢，含水率為15%時有效活菌數(shù)最高，可達5.17×1010CFU·g?1；含水率為10%和20%時，固體菌劑中有效活菌數(shù)可達4.00×1010CFU·g?1以上；含水率為5%和25%時，固體菌劑的儲存效果最差，有效活菌數(shù)僅為2.00×1010CFU·g?1左右。綜上可知，當固體菌劑含水率為10%～20%時，有效活菌數(shù)較高，因此，選用10%、15%、20%作為正交試驗中的3個水平。

圖1 接菌量、保護劑體積分數(shù)和含水率對有效活菌數(shù)的影響Figure 1 Effect of inoculation amount, protective agent concentration and water content on living bacteria count

2.2 正交設計試驗結(jié)果

由表2可知：在接菌量、保護劑體積分數(shù)和含水率等3種因素中，影響程度最大的是接菌量，其次是含水率，影響程度最小的是保護劑體積分數(shù)。固體菌劑制備的最佳配方為A2B3C2，即：接菌量10%、保護劑體積分數(shù)8%、含水率15%。該條件下，菌劑中有效活菌數(shù)達 1.26×1011CFU·g?1，符合GB 20287?2006《農(nóng)用微生物菌劑》的標準(＞0.50×108CFU·g?1)。

表2 正交試驗的極差分析Table 2 Range analysis of orthogonal test

2.3 堆肥試驗結(jié)果

2.3.1 堆肥腐熟指標 pH是評價堆肥腐熟程度的指標之一。堆肥腐熟后，pH一般為7.0～8.5[21]。由表3可知：堆肥結(jié)束時各處理pH均在8.0左右，符合NY 525?2002《有機肥料》標準。

EC可以表示堆肥中可溶性總鹽的含量，其大小能影響植物的生長，EC過高的堆肥產(chǎn)品可以影響土壤理化性質(zhì)，使植物生長受到毒害。EC小于4.00 mS·cm?1，表明堆肥已達到腐熟，對植物生長無毒害[22]。由表3可知：ck處理EC為0.35 mS·cm?1，各處理的EC相近，均小于4.00 mS· cm?1，在腐熟標準之內(nèi)。

表3 堆肥腐熟指標測定結(jié)果Table 3 Determination results of composting maturity index

D(465)/D(665)能反映出胡敏酸分子的穩(wěn)定程度，D(465)/D(665)較大說明胡敏酸相對穩(wěn)定，較小說明胡敏酸結(jié)構簡單，因此可用來分析評價堆肥的腐殖化作用大小[9]。由表3可知：堆肥結(jié)束時，各處理的D(465)/D(665)均為6.0左右。

IG是判斷堆肥產(chǎn)品是否腐熟的生物學指標。堆肥產(chǎn)品未腐熟時會產(chǎn)生對植物生長有毒有害的物質(zhì)，抑制植物的生長。一般情況下，當IG大于80%就可認為產(chǎn)品已達到腐熟[23]。由表3可知：各處理的IG均超過80%，堆肥產(chǎn)品對植物無毒。

綜上可知，堆肥進行40 d后，各處理的pH和EC均達到腐熟標準且無顯著差異，但添加菌劑后可以縮短堆肥腐熟的時間[24]。各處理的D(465)/D(665)均為6.0左右，說明其縮合度和芳構化仍很低，這也從另一方面表明腐殖質(zhì)活性較強[9]。各處理的IG均超過80%，這與ZHANG等[25]測定的園林廢棄物堆肥產(chǎn)品IG一致。

2.3.2 木質(zhì)素酶活力測定結(jié)果 堆肥過程中微生物會分泌各種酶，從而將木質(zhì)素類大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化成腐殖質(zhì)等促進植物生長的物質(zhì)[26]。與木質(zhì)素降解相關的生物酶主要包括漆酶、錳過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶[27]。

在堆肥過程中，漆酶對木質(zhì)素的降解起著非常重要的作用，研究漆酶活力的變化對評價堆肥進程及微生物活動強度至關重要[28]。由圖2A可看出：除T3外，其余處理漆酶活力在初始階段相差不大，呈現(xiàn)先降后升趨勢，與陳建軍等[29]研究結(jié)果一致?？赡苁嵌逊什牧现心承┬》肿游镔|(zhì)先降解，之后微生物再降解木質(zhì)素類難降解的大分子物質(zhì)。T3酶活力先升后降，可能與其開始微生物數(shù)量較多，分解速率較高有關。堆肥進行到24 d時，T1、T2和T3漆酶活力遠超過ck，說明添加自制菌劑與市售菌劑都可大大增強堆肥中微生物的活動強度，隨著微生物菌落增多，產(chǎn)酶能力也增加。第24 天之后，T3酶活力下降，ck酶活力上升，T1與T2酶活力變化不大，且大小相當，均達80 U·L?1(1 U=16.67 nkat)左右。菌株No.11的研究結(jié)果也顯示：與可高效降解木質(zhì)素的黃孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium相比，此菌株有更強的產(chǎn)酶能力，也進一步說明自制固體菌劑有更大的應用潛力。

錳過氧化物酶是一種酚氧化物酶，可與其他酶共同作用提高對木質(zhì)素的降解作用[10]。由圖2B可看出：添加菌劑的處理組錳過氧化物酶活力均高于ck，說明添加菌劑可以提高堆肥中錳過氧化物酶的酶活力。堆肥初始階段，所有處理組的錳過氧化物酶活力均出現(xiàn)先降后升趨勢，可能與堆肥中的氮素含量有關，氮素含量會影響微生物分泌錳過氧化物酶[27]。第8 天后所有處理組酶活力又出現(xiàn)了上升趨勢，說明微生物代謝活動增強，開始分泌錳過氧化物酶，T2與T3在第16天時達到峰值，T1的峰值出現(xiàn)在第24天左右。這表明添加自制固體菌劑后菌株可較快適應環(huán)境分泌錳過氧化物酶。有研究表明：錳過氧化物酶在限氮高錳培養(yǎng)基中產(chǎn)量較高[10]，因此制備此類菌劑時，可通過優(yōu)化含氮量提高產(chǎn)錳過氧化物酶的能力。

木質(zhì)素過氧化物酶是一種含亞鐵血紅素的過氧化物酶，可直接與芳香底物發(fā)生反應，也可通過氧化低分子量的中介體而間接地發(fā)揮作用[30]。由圖2C可看出：所有處理組木質(zhì)素過氧化物酶活力均呈現(xiàn)先升后降趨勢，添加菌劑的處理組酶活力的峰值出現(xiàn)時間均早于ck，且峰值高于ck，表明加入菌劑后可明顯提高微生物分泌木質(zhì)素過氧化酶的速率[31]。堆肥的后期，木質(zhì)素過氧化酶顯著降低，分析原因可能與此時碳氮比的變化有關。

圖2 堆肥過程中漆酶、錳過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶酶活力變化Figure 2 Changes of laccase, manganese peroxidase and lignin peroxidase activity during composting

2.3.3 木質(zhì)素和纖維素降解率測定結(jié)果 木質(zhì)素是一種在自然界中廣泛存在的有機高分子化合物，多存在于植物的細胞壁中[32]。木質(zhì)素的完全降解由細菌、放線菌和真菌共同參與，其中真菌起重要作用[33]。由圖3可看出：添加菌劑的處理木質(zhì)素與纖維素降解率均高于ck，T3木質(zhì)素降解率達46.65%，其次是T2，木質(zhì)素降解率為30.43%，而T1的木質(zhì)素降解率僅為21.74%。

圖3 不同處理的木質(zhì)素和纖維素降解率Figure 3 Degradation rate of lignin and cellulose in different treatments

纖維素是植物細胞壁的主要結(jié)構成分，通常與半纖維素和木質(zhì)素結(jié)合在一起[34]。自然界中有許多微生物可以通過酶的作用分解植物殘體中的纖維素，但細胞壁中木質(zhì)素對纖維素起到保護作用，所以木質(zhì)素和纖維素的分解都受到限制[6]。由圖3可知：添加菌劑后可提高園林廢棄物堆肥中纖維素降解率，其中T1降解率為18.33%，T2降解率為16.67%，T3纖維素降解率最高，達30.00%。

綜上可知，T2木質(zhì)素降解率高于T1，說明自制固體菌劑對園林廢棄物中木質(zhì)素的降解效果較好。纖維素降解率結(jié)果顯示：T1略強于T2，這可能是因為市售菌劑中的菌株對纖維素降解能力較好，而自制固體菌劑中的菌株主要產(chǎn)生木質(zhì)素降解相關酶，對木質(zhì)素的降解效果較好。T3的木質(zhì)素降解率與纖維素降解率均高于T2，說明在考慮成本的前提下，需進一步研究自制固體菌劑的添加量，以獲得最大經(jīng)濟效益。與王順利等[35]制備出堆肥菌劑CC-1相比，接菌量相當?shù)那闆r下添加自制固體菌劑可使纖維素降解率提高11.68%，木質(zhì)素降解率提高46.65%。這可能與菌株No.11的特殊菌絲結(jié)構有關，同時說明自制固體菌劑可高效降解木質(zhì)素和纖維素。與尹爽等[36]研制的復合菌劑相比，添加自制固體菌劑木質(zhì)素降解率較高，可能是因為自制固體菌劑更易于微生物在堆肥中均勻生長，能極大程度地發(fā)揮降解作用。自制固體菌劑可以較好地分解園林廢棄物中的木質(zhì)素，并能提高纖維素降解率。

3 結(jié)論

木質(zhì)素降解菌No.11的最佳固定化條件為：接菌量10%、保護劑體積分數(shù)8%、含水率15%。在此條件下，獲得的固體菌劑成品保存30 d后，其有效活菌數(shù)達1.26×1011CFU·g?1，符合GB 20287?2006《農(nóng)用微生物菌劑》的要求。

添加自制固體菌劑的堆肥產(chǎn)品pH為8.01，達到NY 525?2002《有機肥料》標準，EC為0.34 mS·cm?1，D(465)/D(665)為6.26，IG達118%，對植物無毒。

堆肥中添加自制木質(zhì)素降解固體菌劑有利于木質(zhì)素降解酶系的產(chǎn)生，漆酶、錳過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶的酶活力均得到提升。與不添加菌劑相比，木質(zhì)素降解率提高23.91%，纖維素降解率提高8.34%；0.5%接種比例下，與EM菌相比，纖維素降解率未提高，木質(zhì)素降解率提高8.69%。