毛竹早期光誘導蛋白基因克隆及功能分析

婁永峰，高志民

（1. 江西省林業科學院 江西省植物生物技術重點實驗室，江西 南昌 330032；2. 國際竹藤中心 竹藤資源基因科學與基因產業化研究所 國家林業和草原局/北京市共建竹藤科學與技術重點開放實驗室，北京 100102）

綠色植物吸收光能主要依靠捕光色素蛋白復合體(light harvesting complex，LHC)完成，該復合體由LHC基因家族編碼的蛋白結合葉綠素和類胡蘿卜素組成，而這些LHC基因的表達是受光照調控的。強光可以抑制LHC基因的轉錄表達，同時能誘導一些本身具有光保護功能的LHC-Like基因表達，例如強光下OHPs(one helix proteins)、SEPs(stress enhanced proteins)和ELIPs(early light induced proteins)基因的表達增加[1?2]。ELIPs是核基因編碼的受光誘導的葉綠體類囊體膜蛋白，最早發現于豌豆Pisum sativum黃化苗轉綠過程。在此過程中ELIPs比其他的光誘導蛋白出現的更早，并在光合細胞器葉綠體發育完全后迅速消失[3?4]。ELIPs在蛋白結構上高度保守，目前已知的所有ELIPs都有3個α-螺旋跨膜結構，其中螺旋Ⅰ和螺旋Ⅲ與光系統中所有捕光葉綠素a/b結合蛋白相應部位有很高的序列同源性，因此ELIP蛋白被歸入葉綠素a/b結合蛋白超家族，并根據其跨膜螺旋數量分為3個亞組[2,5]。目前，已經在擬南芥Arabidopsis thaliana[6]、葡萄Vitis vinifera[7]、紫花苜蓿Medicago sativa[8]、銀杏Ginkgo biloba[9]等多種植物中克隆鑒定獲得了ELIP基因。有關ELIP蛋白基因功能的研究也越來越得到研究者的重視。ELIPs是在有光的情況下產生的，在類囊體色素-蛋白質復合物的光保護或組裝中起作用，也可在葉綠體到有色體的轉換中發揮作用，對光合作用系統起到光修復作用[10?12]。一些ELIP基因在山墻蘚Tortula ruralis中被干旱激活[13]，在豌豆中能被紫外線B波段(UV-B)激活[14]，在小麥Triticum aestivum中被低溫激活[15]。推測ELIPs除了具有光保護功能外，可能具有適應與光抑制有關的非生物脅迫環境的功能[16]。此外，在擬南芥中發現，AtELIP1和AtELIP2基因的缺失會使其種子萌發率下降，且ELIP蛋白的抑制因子DAG1突變后，擬南芥種子萌發率則高于野生型，表明ELIP蛋白具有促進種子萌發的作用[17]。可見ELIPs在多種生理過程中可能具有重要作用。毛竹Phyllostachys edulis是重要的森林資源，生長迅速，材質優良，其光合作用一直倍受關注。人們已從竹子光合作用生理特性[18?19]、分子機理[20?25]等方面進行了大量研究。然而，對于毛竹的ELIPs尚缺乏研究。本研究以毛竹為研究對象，克隆ELIP基因，全面分析它的分子特征及表達模式，構建了PeELIP3表達載體并轉化模式植物擬南芥，對基因功能進行了初步分析，以期為深入研究ELIP基因在竹子光保護中的生物學功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

以實驗室培養的毛竹實生苗為材料。培養條件：溫度為18～25 ℃，光周期為16 h/8 h，光照強度為250～350 μmol·m?2·s?1，待長至 6個月時進行光照處理。光強處理：將毛竹實生苗在黑暗適應 24 h后分別移至于不同的光照強度 (0、300、600、900、1 200 和 1 500 μmol·m?2·s?1)下，處理 2 h 后取樣。強光處理：將毛竹實生苗置于 1 200 μmol·m?2·s?1的強光下，分別在處理后 0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和12.0 h時取樣。黃化苗處理：在黑暗條件下培養毛竹實生黃化苗，待長至1個月時，將毛竹黃化苗放置在 250～350 μmol·m?2·s?1的光照下進行處理，分別在處理后 0、0.5、1.0、4.0 和 8.0 h 取樣，并以室內正常光照 (250～350 μmol·m?2·s?1)條件下生長的毛竹實生苗為對照 (ck)。3 次重復，每次重復的每個處理4～6株毛竹實生苗，所有處理均取苗頂端第3片葉為樣本，液氮速凍后置于?80 ℃保存備用。

1.2 毛竹 ELIP 基因克隆與序列分析

從前期毛竹基因組測序和RNA-Seq結果[22,26]中篩選出與擬南芥ELIPs相似的基因，暫時將其認定為毛竹ELIP基因，并根據其序列設計特異性擴增引物(表1)，進行目的基因擴增。利用Trizol法提取毛竹葉片的總RNA，并使用反轉錄試劑盒(Promage，美國)合成cDNA作為模板。PCR產物經瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒完成回收，然后連接到pGEM-T easy Vector，轉化大腸埃希菌Escherichia coliDH5α感受態細胞，篩選陽性克隆，在生工生物工程(上海)股份有限公司進行基因測序。

表1 引物序列Table 1 Sequence of primers

對克隆獲得的基因及其編碼的氨基酸序列進行分析，其中編碼蛋白的基本理化性質通過ExPasy(http://www.expasy.org/)在線工具獲取，相應功能結構域分析使用美國國家生物信息中心(NCBI)鏈接的在線數據庫CD Search (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)；利用Plant-mPLoc (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant/#)和WoLF PSORT (https://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html)預測亞細胞定位。此外，利用MEGA 7.0[27]提供的Clustal W工具對毛竹ELIP基因編碼的氨基酸序列與其他物種ELIPs序列進行比對分析，且使用鄰接法(neighbor-joining)構建系統進化樹，重復次數1 000次，其他參數使用系統默認值。

1.3 毛竹 ELIPs基因的表達分析

根據獲得的毛竹ELIP基因序列的非保守區域設計定量引物(表1)。利用qRT-PCR技術分析毛竹ELIP基因在不同光照處理條件下的表達模式，反應在qTower熒光定量PCR儀上進行，體系為10.0 μL：2 × SYBR Ⅱ Green 1 Master 5.0 μL；正/反向引物各 0.3 μL (10 μmol·L?1)；cDNA 模板 1.0 μL；H2O 3.4 μL。兩步法進行PCR擴增：95 ℃ 6 min；95 ℃ 10 s，62 ℃ 10 s，40個循環。選擇PeNTB為內參基因[28]，基因的表達變化情況采用 2–ΔΔCt法分析[29]。

1.4 PeELIP3 植物表達載體構建

通過PCR擴增得到兩端分別帶有BamHⅠ和XbaⅠ酶切位點的PeELIP3基因片段，酶切回收純化后，將目的片段連接到pCAMBIA1301載體的多克隆位點，得到重組質粒pCAMBIA1301-PeELIP3。經測序驗證正確后，將植物表達載體質粒利用電擊法導入農桿菌Agrobacterium tumefaciensEHA105菌株，并經PCR驗證正確后用于轉化擬南芥。

1.5 轉化擬南芥、篩選與鑒定

利用農桿菌介導的浸花法[30]轉化擬南芥，獲得的T0代擬南芥種子經消毒后播種在含50 mg·L?1潮霉素的1/2 MS培養基中培養，初步挑選出具有抗性的轉基因植株，并移栽到營養土中。提取T1代候選轉基因植株的DNA，經PCR擴增PeELIP3基因序列，進一步鑒定轉基因植株。在此基礎上，篩選轉基因植株至T3代，進行后續分析。同時，利用半定量RT-PCR檢測PeELIP3在轉基因擬南芥中的表達水平[23]。

1.6 轉基因植株葉綠素熒光參數及熒光成像初步分析

參照韓志國等[31]方法，以3周的擬南芥植株為材料，利用IMAGING-PAM葉綠素熒光儀進行葉綠素熒光參數的測定，包括光系統Ⅱ最大光化學效率(Fv/Fm)、非光化學猝滅(NPQ)誘導曲線等。同時獲取擬南芥的葉綠素熒光成像，分析野生型與轉基因擬南芥植株之間的非光化學猝滅差異。

2 結果和分析

2.1 PeELIPs基因克隆和序列分析

經基因克隆、測序、序列分析和鑒定，從毛竹中獲得3個ELIP同源基因，分別命名為PeELIP1、PeELIP2和PeELIP3。序列分析表明：3個PeELIPs基因的開放閱讀框分別為498、540和549 bp，對應編碼氨基酸大小分別為165、179和182個氨基酸，預測蛋白分子量為16.70、18.42和18.61 kDa。用DNAMAN分析3個PeELIPs基因編碼的氨基酸序列，發現它們相互之間具有高度的相似性(80%以上)，其中PeELIP2和PeELIP3之間達到91.1%。分別對3個PeELIPs蛋白的保守結構域進行預測，結果顯示：它們的蛋白序列中都含有典型的捕光葉綠素a/b結合蛋白功能域，同時在該結構上都有3個α-螺旋跨膜結構，其中第1、3跨膜α-螺旋高度保守，且包括2個葉綠素結合位點：谷氨酸(Glu)殘基和天冬酰胺(Asn)殘基(圖1)，這一結構域是捕光葉綠素a/b結合蛋白的典型結構域[1,5]。因此，3個PeELIPs均屬于葉綠素a/b結合蛋白超家族成員。序列比對分析發現：3個PeELIPs與水稻Oryza sativa、玉米Zea mays等單子葉植物的ELIPs具有較高的相似性，同源性達72%以上，而與擬南芥等雙子葉植物的ELIPs相似性較低，同源性低于67%。

用Plant-PLoc在線軟件進行亞細胞定位預測顯示：PeELIP1和PeELIP2蛋白定位于葉綠體，而PeELIP3蛋白則定位在線粒體中。為了使預測結果更加準確，使用蛋白亞細胞定位預測專業軟件WoLF PSORT在線對PeELIPs蛋白再次進行預測，結果顯示：PeELIP1、PeELIP2和PeELIP3都最有可能定位于葉綠體中，進一步支持了它們屬于葉綠素a/b結合蛋白超家族成員。

圖1 毛竹與擬南芥、水稻、玉米的ELIPs氨基酸序列比對Figure 1 Alignment of the deduced amino acid sequences of ELIPs from Ph. edulis, A. thaliana, O. sativa and Z. mays

2.2 ELIPs 系統進化分析

為揭示PeELIPs與其他物種ELIPs之間的進化關系，將PeELIPs與擬南芥、水稻、小立碗蘚Physcomitrellapatens等18個不同物種ELIPs的氨基酸序列進行比對分析，并構建進化樹。結果(圖2)表明：ELIPs進化可分為四大類，包括被子植物(雙子葉植物和單子葉植物)、藻類、苔蘚及裸子植物。毛竹ELIPs與水稻、玉米等單子葉植物ELIPs聚在一起，說明毛竹ELIPs與單子葉植物ELIPs蛋白具有較近的親緣關系，然后是雙子葉植物，與裸子植物、苔蘚植物及藻類家族的親緣關系較遠，這與植物系統發育分類結果相一致。

圖2 基于ELIPs氨基酸序列構建的系統進化樹Figure 2 Phylogenetic tree based on the amino acid sequences of ELIPs

2.3 PeELIPs 基因的表達分析

為分析光照對PeELIPs基因表達的影響，選擇毛竹實生苗中的黃化苗為材料，進行光照處理(光照強度 250～350 μmol·m?2·s?1)，以綠色正常苗為對照 (ck)。qRT-PCR 結果 (圖3)顯示：PeELIPs在毛竹黃化苗中僅檢測到微量的表達，而在光照條件處理后黃化苗中3個PeELIPs的基因表達量均顯著增加，其中PeELIP1和PeELIP2的表達量在光照處理的前1.0 h內快速增加，分別在0.5和1.0 h達峰值，與未光照處理的黃化苗相比，分別增加約21倍和58倍，隨后出現下降趨勢，至8.0 h時仍然高于ck，分別約為ck的2倍和4倍。而PeELIP3的表達量隨光照處理時間的延長而上升，在4.0 h以后逐漸趨向平穩，在光照8.0 h后，其表達量約是對照的12倍，是黃化苗的20倍。

圖3 PeELIPs在毛竹黃化苗中的表達分析Figure 3 Expression analysis of PeELIPs in etiolated seedlings of moso bamboo

為進一步研究光照對PeELIPs基因表達的影響，選擇不同光照強度(0、300、600、900、1 200和1 500 μmol·m?2·s?1)處理正常生長的毛竹實生苗葉片，檢測其中PeELIPs的表達情況。qRT-PCR結果(圖4)顯示：隨著光照強度增加，PeELIPs的表達量均比對照 (0 h)增加，經 1 500 μmol·m?2·s?1的光強處理2 h后，PeELIP1、PeELIP2和PeELIP3的表達量分別約是光照處理前的22、18和13倍，約是正常培養條件 (300 μmol·m?2·s?1)下的 7、9 和 12 倍。在強光條件 (1 200 μmol·m?2·s?1)下，隨著處理時間的延長，PeELIPs的表達量都是先快速上升，隨后變化不大，整體趨向平穩(圖5)。毛竹黃化苗和正常苗中PeELIPs在不同光照強度、不同處理時間的表達變化表明，PeELIPs基因的表達受光照的誘導，且在光照初期的表達變化更為明顯，進一步說明了PeELIPs編碼的蛋白符合光早期誘導表達蛋白的特點。

圖4 不同光照強度處理下PeELIPs的表達分析Figure 4 Expression analysis of PeELIPs under different light intensity

圖5 強光 (1 200 μmol·m?2·s?1)脅迫下 PeELIPs的表達分析Figure 5 Expression profile analysis of PeELIPs under high light stress(1 200 μmol·m?2·s?1)

2.4 PeELIP3 轉基因擬南芥鑒定

為驗證PeELIPs基因的功能，選擇其中1個基因PeELIP3構建了表達植物載體pCAMBIA1301-PeELIP3。將pCAMBIA1301-PeELIP3重組質粒通過農桿菌介導轉化野生型擬南芥(Col-0)，通過抗性篩選出的T1代擬南芥經基因組PCR和半定量RT-PCR鑒定，結果(圖6A)顯示：獲得的10個抗性轉基因擬南芥中6個株系(L2、L3、L4、L7、L8和L9)可檢測到PeELIP3基因片段，而野生型擬南芥中沒有檢測到。隨后對6個轉基因株系繼續進行培養，至T3代不分離后通過半定量RT-PCR進一步檢測。結果(圖6B)發現：PeELIP3基因在6個株系中均得到了表達，其中L3、L4、L8和L9株系中的表達量略高于L2和L7。這表明：PeELIP3基因已成功導入擬南芥中并得到轉錄表達，但不同株系中的表達量存在一定的差異。正常培養條件下，PeELIP3過量表達沒有引起轉基因擬南芥植株表型的變化。

圖6 PeELIP3轉基因擬南芥PCR鑒定(A)及表達檢測(B)Figure 6 Detection of transgenic Arabidopsis by PCR (A) and expression analysis of PeELIP3 in transgenic lines (B)

2.5 PeELIP3轉基因擬南芥葉綠素熒光參數分析

強光處理野生型和各轉基因株系擬南芥，結果(圖7)發現：經過4.0 h用1 200 μmol·m?2·s?1的強光處理后，野生型和轉基因擬南芥的Fv/Fm都迅速下降，但兩者的下降幅度存在顯著差異，其中野生型擬南芥的Fv/Fm下降43.8%，而轉基因擬南芥植株的下降幅度明顯低于野生型擬南芥，僅下降25.1%～35.4%。由此表明：1 200 μmol·m?2·s?1強光處理后野生型和各轉基因擬南芥均受到了脅迫，但過量表達PeELIP3可降低轉基因擬南芥受強光脅迫的光抑制，以減緩Fv/Fm的下降程度。

圖7 強光 (1 200 μmol·m?2·s?1)對 PeELIP3 轉基因擬南芥Fv/Fm的影響Figure 7 Effect of high light (1 200μmol·m?2·s?1) on Fv/Fm of PeELIP3 transgenic Arabidopsis

對PeELIP3轉基因植株進行了非光化學猝滅成像和誘導+弛豫動力學分析。非光化學猝滅成像結果顯示：在 185 μmol·m?2·s?1的光強下，野生型和轉基因擬南芥植株的非光化學猝滅成像均顯示為黃色(圖8A)，當光強增加至925 μmol·m?2·s?1時，兩者的非光化學猝滅成像均轉變成青藍色(圖8B)。這說明在弱光或強光下，野生型和轉基因擬南芥植株間的非光化學猝滅沒有明顯差異。同時，隨機選取2個株系(L3和L7)進行非光化學猝滅誘導+弛豫動力學曲線分析。結果表明：在不同的活化光(弱光和強光)下，野生型與轉基因擬南芥植株的非光化學猝滅誘導+弛豫動力學曲線沒有明顯差異，即185 μmol·m?2·s?1活化光下，野生型和轉基因擬南芥的非光化學猝滅系數變化趨勢都是先快速上升到達峰值，然后開始下降(圖8C)；當活化光光強設置為925 μmol·m?2·s?1時，兩者的非光化學猝滅系數都是迅速上升，短時間內到達峰值，然后保持平穩(圖8D)。在關閉活化光，進入暗弛豫后，兩者的非光化學猝滅系數都在約5 min內快速弛豫(圖8C和圖8D)。以上結果表明：PeELIP3基因不影響轉基因植株的非光化學猝滅，可能未參與熱耗散相關的光保護途徑。

圖8 PeELIP3轉基因擬南芥非光化學猝滅分析Figure 8 Analysis of NPQ in PeELIP3 transgenic Arabidopsis

3 討論

早期光誘導蛋白是核編碼的葉綠體蛋白，在植物中廣泛分布。但不同植物間編碼ELIPs的基因數量存在較大差異，部分植物僅含有1個ELIP基因，如豌豆[14]和紫花苜蓿[8]，而茶樹Camellia sinensis[32]、番紅花Crocus sativus[33]、杜鵑Rhododendron catawbiense[34]等部分植物中則有 2～7個差異表達的ELIPs基因。本研究從毛竹中克隆得到了3個PeELIPs，它們分別編碼的蛋白之間具有較高的相似性，均包含葉綠素a/b結合的結構域，屬于捕光葉綠素a/b結合蛋白超家族成員。此外，PeELIPs蛋白與水稻、玉米等單子葉植物的ELIPs蛋白同源性較高，聚類在一個分支，但與苔蘚植物和藻類的同源性相對偏低，這說明不同物種ELIPs蛋白存在較大差異。被子植物(雙子葉和單子葉植物)、苔蘚植物和藻類各自聚在一起，這表明ELIPs蛋白在相同進化等級的物種間相對比較保守，與物種的進化相一致。

大量研究結果表明：光照、溫度、干旱等非生物脅迫影響ELIP基因表達調控。例如，17個旋蒴苣薹Boea hygrometricaELIP基因中有7個基因受到干旱處理誘導[35]，紫花苜蓿MsELIPs和杜鵑RcELIPs在低溫脅迫中基因表達量增加[8,34]。光照是誘導ELIP基因表達的主要因素。本研究中，毛竹黃化苗光照處理過程中，PeELIPs的表達量快速增加，在前1 h中達到頂峰，然后出現下降。這與番茄ELIP基因在其黃化苗轉綠過程中的表達模式類似[36]。此外，3個毛竹PeELIPs的表達量都隨著光照強度增加而上調，這表明光照誘導毛竹PeELIPs表達，其表達模式與擬南芥AtELIP1和AtELIP2[6]、葡萄VvELIP[7]、銀杏GbELIP[9]基因類似。

研究[11]表明：擬南芥chaos突變體因為不能快速積累ELIPs蛋白，對強光和低溫十分敏感，在強光脅迫下擬南芥chaos突變體植株葉片白化，表現出明顯的光氧化現象，但將擬南芥ELIP基因在chaos突變體中組成性表達后，轉基因擬南芥的強光耐受性又恢復到野生型狀態，這表明ELIP蛋白具有光保護功能。鹽藻Dunaliella salinaDsCBR基因轉化擬南芥elip突變體后，轉基因擬南芥的強光耐受性提高到野生水平，這表明DsCBR基因與其高等植物ELIP基因同樣具有光保護功能[37]。過量表達PeELIP3基因可減緩轉基因擬南芥在強光脅迫下Fv/Fm的下降幅度，這表明PeELIP3可降低轉基因擬南芥在強光脅迫中的光抑制程度，具有一定的光保護作用。另外，PeELIP1和PeELIP2的功能如何，有待深入研究。

熱耗散過剩光能是植物重要的光保護途徑，而葉綠素熒光參數非光化學猝滅系數能反映植物耗散過剩光能的能力，即光保護能力[38]。本研究中過表達PeELIP3基因不影響轉基因擬南芥植株的非光化學猝滅，表明PeELIP3可能未參與非光化學猝滅的熱耗散光保護途徑。ELIPs光保護功能可能與其作為色素臨時載體有關，強光脅迫下能加劇葉綠素結合蛋白的破壞，產生游離的葉綠素，而其容易被光敏化，形成葉綠素三聚體，葉綠素三聚體則與氧分子反應形成單線態氧，進而發生光氧化破壞，ELIP蛋白通過與葉綠素的短暫結合，防止游離葉綠素的積累，從而防止光氧化脅迫[11,39]。同時，ELIP蛋白作為葉綠素傳感器可調控葉綠素合成防止過多游離態葉綠素的積累[40]。因此，毛竹PeELIP3基因在光保護中的作用機制需要更多的研究去驗證。