人類表皮生長因子受體2對胃癌細胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響

劉文杰，吳菡，黃建，周武碧

作者單位：南京醫科大學附屬淮安第一醫院病理科，江蘇 淮安223300

胃癌（GC）通常預后較差，目前是全球第四大常見癌癥，且是東亞地區最常見的癌癥。盡管已提出許多策略來提高病人存活率，但晚期GC 患者的中位存活時間仍為約12 個月。因此，需要更深入的探討胃癌的分子發病機制，以改進胃癌治療的新方法。人類表皮生長因子受體2（HER2）屬于表皮生長因子受體（EGFR）家族成員，其在細胞生長、分化、存活相關通路中具有重要作用。市面上最常見的人源化的抗HER2 單抗為曲妥珠單抗，其可通過抑制HER2 二聚體、胞內吞HER2 及抗體依賴細胞介導的細胞毒等途徑抑制腫瘤的惡化。大量研究報道，HER2 在胃癌患者中的表達異常升高。但是，HER2 對胃癌細胞生物性行為的影響未有研究。2018年11月至2019年6月進行本研究，擬通過檢測胃癌細胞中HER2 的表達，探討過表達HER2、敲減HER2 對胃癌細胞增殖、遷移侵襲及凋亡的影響，旨在揭示HER2在胃癌進展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

永生化的正常胃上皮細胞GES-1、胃癌細胞SGC-7901、MGC-803、BGC-823均購自美國菌種保藏中心；噻唑藍試劑（MTT）、胰蛋白酶均購自美國Sellect 公司；Lipofectamine2000、逆轉錄試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒購自大連Takara 公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜購自德國羅氏診斷有限公司；放射免疫沉淀測定（RIPA）蛋白裂解液和電化學發光（ECL）試劑盒均購自碧云天生物技術公司；Matrigel基質膠、Transwell小室購自美國Coming公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 胃癌細胞SGC-7901、MGC-803、BGC-823以及正常胃上皮細胞GES-1均用含10%胎牛血清的DMEM 培養基進行常規培養（37 ℃，含5%二氧化碳）。用胰蛋白酶消化75%匯合細胞，按照1∶3的比例更換培養基，每周傳代3次。

1.2.2 細胞轉染與分組 將正常培養的永生化的正常胃上皮細胞GES-1、胃癌細胞SGC-7901、MGC-803、BGC-823 分別標記為GES-1 組、SGC-7901 組、MGC-803 組、BGC-823 組；將SGC-7901 細胞采用隨機數字表法分為pcDNA 3.1 組、pcDNA 3.1-HER2組、si-NC 組、si-HER2 組。處理方法為，按照脂質體Lipofectamine2000 的試劑盒說明書要求分別將pcDNA 3.1、pcDNA 3.1-HER2、si-NC、si-HER2 轉染至SGC-7901細胞，先用無血清培養液孵育6 h，再更換新鮮培養液繼續培養48 h，western blot 法檢測轉染效果。收集轉染成功細胞用于后續試驗。

1.2.3 qRT-PCR 法檢測細胞中HER2 mRNA 表達Trizol 法 提 取SGC-7901、MGC-803、BGC-823 以 及GES-1 細胞總RNA，微量核酸蛋白測定儀分析各樣本RNA 濃度和純度。調整RNA 樣品濃度，使用Ta-KaRa 反轉錄試劑盒將RNA 反轉錄為cDNA，按照熒光定量試劑盒使用說明配制反應體系，進行qRTPCR 擴增。實驗結果采用2法分析HER2（GAPDH作為內參）的相對表達。

1.2.4 MTT 實驗檢測細胞增殖 取適量pcDNA 3.1組、pcDNA 3.1-HER2組、si-NC組、si-HER2組細胞加入96 孔板，在培養24、48、72 h 時加入20 μL 的MTT工作液（5 g/L）孵育細胞4 h，棄去上清后，向各孔內添加150 μL 二甲基亞砜，緩慢振蕩至結晶溶解，檢測細胞在490 nm波長下吸光度（A）。細胞的增殖活力與各孔A值成正比。

1.2.5

Transwell 小室檢測細胞遷移侵襲 將Transwell 小室置于添加500 μL 的RPMI 1640 培養基（含10%胎牛血清）24 孔板上，放入細胞培養箱平衡30 min。用純RPMI 1640 培養基將pcDNA 3.1 組、pcDNA 3.1-HER2組、si-NC 組、si-HER2組細胞均配制成5×10個/毫升的細胞懸液。在上室內加入200 μL細胞懸液（細胞數約為1×10個）。常規培養24 h 取出上腔，去除上室膜上未遷移細胞，甲醇固定30 min，1 g/L 結晶紫染液染色20 min。雙蒸水洗去染色液。將Transwell 小室放在倒置顯微鏡下拍照（400 倍），計數5個不同視野（上、下、左、右、中）的總細胞數取平均值記為遷移細胞數。

取60 μL 按照1∶8 比例稀釋基質膠包被Transwell 小室上表面，置于培養箱當基質膠凝固后備用，其他步驟同遷移實驗。

1.2.6

Annexin V-FITC/PI 流式細胞術實驗 用500 μL 的Binding Bμffer 懸浮pcDNA 3.1 組、pcDNA 3.1-HER2 組、si-NC 組、si-HER2 組細胞，加入5 μL的Annexin V-/FITC 置于暗盒內反應20 min，再添加5 μL的PI反應20 min。用300目銅篩過濾后上流式細胞儀檢測。采用早期凋亡率和晚期凋亡率之和表示細胞凋亡率。

1.2.7

Western Blot檢測細胞中HER2、p16、p21、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、裂解的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（cleaved-PARP）、裂解的半胱氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3）的蛋白表達 將pcDNA 3.1組、pcDNA 3.1-HER2組、si-NC組、si-HER2組細胞置于冰上，用RIPA法提取各組細胞蛋白樣品。定量后，向適量蛋白樣品中加入4備體積的上樣緩沖液（×5），經100 ℃加熱10 min變性蛋白。每組均取60 μg樣品按照100 V、110 min進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，利用標準濕式轉膜裝置20 mA轉膜過夜。隨后將聚偏二氟乙烯（PVDF）膜置于孵育盒，室溫下加入5%脫脂奶粉孵育1 h，再在4 ℃下加入1∶500～1∶1 000稀釋的一抗孵育12 h，最后在室溫下用1∶1 500稀釋的二抗中反應2 h。將孵育盒置于暗室內，進行化學發光顯影。凝膠成像系統采集圖像，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參，Quantity One 4.62軟件分析目的條帶相對灰度值表示目的蛋白表達量。

1.3 統計學方法

統計分析采用SPSS 21.0 軟件進行。每個樣本設置3 個生物學重復，實驗重復3 次。計量資料用x ± s表示，采用t檢驗，多組間兩兩比較采用單因素方差分析和Bonferroni 校正的t 檢驗。P ＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌細胞中HER2 的表達

SGC-7901、MGC-803、BGC-823 細 胞 中HER2 的mRNA 表 達（t =4.163，14.896，19.580；P = 0.0002，0.000，0.000）和蛋白表達（t = 20.834，15.497，13.957；P = 0.000，0.000，0.000）均顯著高于GES-1細胞。見圖1、表1。

圖1 人類表皮生長因子受體2（HER2）在胃癌細胞中的蛋白表達

表1 人類表皮生長因子受體2（HER2）在胃癌細胞中的表達（n=9）/x ± s

2.2 過表達HER2 對胃癌細胞增殖的影響

pcDNA 3.1-HER2 組SGC-7901 細胞中HER2 表達高于pcDNA 3.1 組，細胞增殖活力（48、72 h 時）顯著高于pcDNA 3.1組（P ＜0.05）。見圖2、表2。

圖2 過表達人類表皮生長因子受體2（HER2）的胃癌細胞中HER2蛋白表達

表2 過表達人類表皮生長因子受體2（HER2）對胃癌細胞增殖的影響（n=9）/x ± s

2.3 過表達HER2 對胃癌細胞遷移侵襲的影響

pcDNA 3.1-HER2 組SGC-7901 細胞中HER2 的蛋白表達顯著高于pcDNA 3.1 組，細胞的遷移細胞數和侵襲細胞數均高于pcDNA 3.1 組（P ＜0.05）。見圖3A、圖3C，表3。

表3 過表達人類表皮生長因子受體2（HER2）對胃癌細胞遷移侵襲的影響（n=9）/x ± s

2.4 過表達HER2 對胃癌細胞凋亡的影響

pcDNA 3.1-HER2組SGC-7901細胞中HER2表達顯著高于pcDNA 3.1組，細胞凋亡率顯著低于pcDNA 3.1組（P ＜0.05）。見圖3B、圖3D，表4。

表4 過表達人類表皮生長因子受體2（HER2）對胃癌細胞凋亡的影響（n=9）/x ± s

2.5 敲減HER2 對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響

與si-NC 組相比，si-HER2 組SGC-7901細胞中HER2 表達顯著低于si-NC 組。si-HER2 組SGC-7901 細胞增殖活力（48、72 h 時）、遷移細胞數和侵襲細胞數顯著低于si-NC 組，細胞凋亡率顯著高于si-NC 組。與pcDNA 3.1 組相比，pcDNA 3.1-HER2 組SGC-7901 細胞中p16、p21、cleaved-PARP、cleaved caspase-3 蛋白表達均顯著降低，MMP-9、MMP-2 蛋白表達均顯著升高，與si-NC 組相比，si-HER2組細胞中p16、p21、cleaved-PARP、cleaved caspase-3 蛋白表達均顯著升高，MMP-9、MMP-2 蛋白表達均顯著降低。見圖4和表5，6。

3 討論

HER2是位于染色體位置17q21的原癌基因，在上皮，間充質和神經起源的組織中編碼185 kDa 的跨膜糖蛋白。HER2 屬于受體酪氨酸激酶家族，其包含4 個成員：HER1（又稱ERBB1），HER2（又稱ERBB2），HER3（又 稱ERBB3）和HER4（又 稱ERBB4）。來自這些受體的信號轉導由配體與受體細胞外結構域結合，然后受體二聚化和細胞質結構域內特定酪氨酸殘基的反式自磷酸化引發。然而，HER2 是一種孤兒受體，并且始終處于活躍的構象。在HERs 中，HER2 是與其他HER 受體異二聚化的優選結合伴侶，并且在過表達時也是同二聚化的。HER2 的同源和異源二聚化導致幾種信號傳導途徑的激活，包括磷脂酰肌醇-3-羥激酶（PI3K）/蛋白激酶（AKT）和絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）途徑以及許多其他關鍵信號傳導元件，如信號轉導與轉錄激活因子3（STAT3）和c-JUN。這些信號通路調節細胞分裂、增殖、存活、遷移、分化、凋亡等細胞運動。此外，據報道，HER2 的羧基末端部分（約90～100 kDA 稱為p95HER2）在其切割后易位至細胞核，并作為核因子在某些基因的轉錄調控中相互作用。張婷等在胃癌的研究中早已報道，HER2 高表達與胃癌患者較低的分化程度有關。崔建新及有關研究報道，HER2 可調控曲妥珠單抗對胃癌患者的治療效果，其在胃癌的診斷及靶向治療中均具有重要意義。劉曉偉與張宏在胃癌的研究中發現，HER2 的表達水平與癌組織的分化具有緊密相關性，與患者的性別、年齡、腫瘤轉移浸潤程度無關。令人遺憾的是，HER2 在胃癌細胞中的表達及對胃癌細胞的細胞表型變化的影響并未進行深入的研究。本研究表明，胃癌細胞SGC-7901、MGC-803、BGC-823 中HER2 在mRNA 和蛋白水平的表達均明顯升高，這與胃癌癌組織中HER2 呈高表達相一致。本研究選擇HER2 表達差異較大的SGC-7901 細胞進行體外研究，結果表明，過表達HER2 顯著增加SGC-7901 細胞的增殖、遷移侵襲能力，并降低凋亡率，而敲減HER2 則可抑制SGC-7901 細胞的增殖、遷移侵襲并促進凋亡，這說明HER2 對胃癌細胞的惡性表型變化具有促進作用，這為探索HER2 在胃癌細胞中的功能機制提供充分的支持。深入研究發現，HER2 可調控胃癌細胞增殖相關蛋白p16、p21，遷移侵襲相關蛋白MMP-9、MMP-2 和凋亡相關蛋白cleaved-PARP、cleaved caspase-3 的表達，提示HER2 對胃癌細胞惡性生物學行為的調控機制可能與調控p16、p21、MMP-9、MMP-2、cleaved-PARP、cleaved caspase-3 的表達相關。這為HER2在胃癌細胞中的作用機制研究提供參考。

表5 敲減人類表皮生長因子受體2（HER2）對胃癌細胞SGC-7901增殖、遷移侵襲及凋亡的影響（n=9）/x ± s

表6 人類表皮生長因子受體2（HER2）表達改變對胃癌細胞SGC-7901增殖、遷移侵襲及凋亡相關蛋白表達量的影響（n=9）/x ± s

綜上所述，HER2 可促進胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制凋亡，其作用機制與調控p16、p21、MMP-9、MMP-2、cleaved-PARP、cleaved caspase-3 的表達相關，為HER2 生物制劑在胃癌治療中的應用提供支持。

（本文圖3，4見插圖2-2）