山楂多糖提取物上調miR-146a-5p抑制Wnt/β-catenin信號通路影響胃癌細胞增殖和凋亡

李孝平，李偉，高芳芳，黃朝剛，何天佑，孫智珺

作者單位：武漢市第三醫院普外科，湖北 武漢430060

胃癌是我國常見的消化道惡性腫瘤之一，嚴重威脅我國人民的生命健康，近年來研究發現中醫藥對胃癌的防治具有良好療效。中藥多糖可通過藥理因素調節人體免疫功能，且具有抗腫瘤作用，能夠為醫學臨床腫瘤治療提供有效幫助。研究報道獼猴桃根多糖、紅花多糖可抑制人胃癌SGC-7901細胞增殖，誘導其凋亡。山楂多糖是山楂中有效生物活性物質，具有抗疲勞、增強免疫力、抗氧化、抗腫瘤以及調血脂等藥理作用。有研究發現山楂多糖提取物可誘導人結腸癌細胞凋亡。而山楂多糖提取物對胃癌細胞增殖和凋亡的影響及其機制尚未可知。miRNA 能夠調節細胞增殖、分化和凋亡等多種生物過程，參與調控多種癌癥發生，也與胃癌進程相關。研究發現過表達miR-146a-5p 在非小細胞肺癌中起抑癌作用。人參皂苷Rh2 通過上調miR-146a-5p 抑制肝癌細胞增殖，誘導細胞凋亡。高腹膜轉移潛能的胃癌細胞中miR-146a-5p 下調表達。然而miR-146a-5p 對胃癌細胞增殖和凋亡的影響尚未清楚。本研究自2018 年3 月至2019 年3月研究山楂多糖提取物對胃癌細胞增殖和凋亡的影響及其機制及與miR-146a-5p的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

胃癌細胞AGS 購自中國科學院上海細胞庫；RPMI-1640 培養基購自美國Gibco 公司；四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）試劑盒、Annexin V-FITC/PI 試劑盒購自日本同仁研究所；蛋白提取試劑盒購自美國Epigentek 公司；Trizol 試劑、熒光定量試劑盒購自美國Progema公司。

1.2 方法

1.2.1

山楂多糖提取物的制備 山楂購自本地大型超市，將山楂洗凈后切片、烘干，按料液比1∶20的比例加入蒸餾水后打漿，90 ℃熱水浴提取6 h，加入0.1%的果膠酶45 ℃提取3 h，于80 ℃下滅酶10 min，離心收集上清液并濃縮，將濃縮液用95%的乙醇醇沉，離心收集沉淀，將沉淀復溶于水中，再次醇沉，離心收集沉淀，置于烘箱中烘干至恒重，得山楂多糖提取物。

將所得提取物經苯酚-硫酸法檢測其為多糖提取物；將該粗多糖提取物加入胰蛋白酶于65 ℃孵育2 h，離心后去除沉淀，得到脫蛋白的多糖溶液；將其轉移到層析袋中進行反復透析48 h，然后離心、濃縮、醇沉，得到半純品；再將半純品多糖用Sephadex G-100 凝膠柱層析，得純多糖提取物。然后檢測多糖含量。

制作標準曲線：稱取4 mg葡萄糖溶于100 mL純水中，分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 補水至1.0 mL，然后加入5%苯酚1.0 mL 和濃硫酸0.5 mL，搖勻，靜置20 min 后檢測490 nm 處吸光度值，以水為空白對照做同樣顯色處理。橫坐標為吸光度值，縱坐標為糖含量。取1.0 mL 的多糖溶液按上述步驟操作，測吸光度值，以標準曲線作測多糖含量。用高效液相凝膠色譜法檢測多糖純度。

1.2.2

細胞培養與分組 胃癌細胞AGS 用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養液培養，取對數生長期AGS 細胞，分別為200、400、800 μg/mL 的山楂多糖提取物處理，作為不同濃度山楂多糖提取物組；正常培養的細胞作為對照（NC）組；用800 μg/mL 的甘露醇處理作等滲對照，記為800 μg/mL 甘露醇組。將miR-146a-5p 過表達載體及陰性對照轉染至AGS細胞中，作為miR-NC 組、miR-146a-5p 組；將miR-146a-5p 抑制劑及陰性對照轉染至AGS 細胞后用濃度為800 μg/mL 的山楂多糖提取物處理，作為antimiR-NC+山楂多糖提取物組、anti-miR-146a-5p+山楂多糖提取物組。轉染均按照Lipofectamine2000試劑盒進行操作。

1.2.3

MTT 檢測細胞增殖率 細胞培養48 h，按試劑盒說明操作，用酶標儀檢測490 nm 處吸光度（OD）值。

1.2.4

流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集培養48 h的細胞，按試劑盒說明操作，上流式細胞儀檢測。

1.2.5

蛋白質印跡法（Western Blot）檢測蛋白cyclinD1、cleaved-caspase-3、β-catenin 表達 提取細胞總蛋白，定量后取50 μg 進行SDS-PAGE，轉至PVDF 膜，封閉后加入一抗4 ℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育2 h，暗室中曝光顯影，定影，測定各組蛋白條帶的灰度值，計算蛋白表達水平。

1.2.6

實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測miR-146a-5p 表達水平 提取細胞總RNA，合成cDNA，進行PCR 擴增，循環條件為95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延長30 s，共40 個循環；相對表達量采用2法計算。

1.3 統計學方法

實驗數據經SPSS 20.0 分析，計量資料用x ± s 表示，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，以P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度山楂多糖提取物對胃癌細胞AGS 增殖的影響

對照組胃癌細胞AGS 的增殖率為（100.10±10.02）%，200、400、800 μg/mL 山楂多糖提取 物 組 分 別 為（85.12±8.51）%、（68.22±6.82）%和（42.11±4.21）%，與對照組相比，200、400、800 μg/mL山楂多糖提取物組胃癌細胞AGS 的增殖率降低（F=31.314，P ＜0.05）。

圖1 不同濃度山楂多糖提取物對胃癌細胞AGS凋亡的影響：A為細胞凋亡流式圖；B為cleaved-caspase-3蛋白表達印跡圖

2.2 不同濃度山楂多糖提取物對胃癌細胞AGS 凋亡的影響

與對照組相比，800 μg/mL 甘露醇組AGS 細胞的凋亡率、cleaved-caspase-3的表達水平無顯著變化；而不同濃度山楂多糖提取物組胃癌細胞AGS 凋亡率升高，cleaved-caspase-3 表達水平升高（P ＜0.05）（圖1，表1）。

表1 不同濃度山楂多糖提取物胃癌細胞AGS凋亡的影響（n=3）/x ± s

2.3 山楂多糖提取物對miR-146a-5p 表達的影響

與對照組相比，山楂多糖提取物組胃癌細胞AGS 中miR-146a-5p 表達水平升高［（1.00±0.10）比（2.89±0.29），t=10.672，P ＜0.05］。

2.4 高表達miR-146a-5p 對胃癌細胞AGS 增殖和凋亡的影響

與miR-NC 組相比，miR-146a-5p 組胃癌細胞AGS 中miR-146a-5p 表達水平升高，cyclinD1表達水平降低，AGS細胞的增殖率降低，AGS細胞中cleaved-caspase-3表達水平升高，AGS細胞的凋亡率升高（P ＜0.05）（圖2，表2）。

圖2 高表達miR-146a-5p對cyclinD1、cleaved-caspase-3蛋白表達的影響

2.5 低表達miR-146a-5p 可以部分逆轉山楂多糖提取物對胃癌細胞AGS 增殖和凋亡的影響

與anti-miR-NC+山楂多糖提取物組相比，anti-miR-146a-5p+山楂多糖提取物組胃癌細胞AGS 中miR-146a-5p表達水平降低，cyclinD1表達水平升高，AGS細胞的增殖率升高，AGS細胞中cleaved-caspase-3表達水平降低，AGS 細胞的凋亡率降低（P ＜0.05）。見圖3，表3。

表2 高表達miR-146a-5p對胃癌細胞AGS增殖和凋亡的影響（n=3）/x ± s

表3 低表達miR-146a-5p可以部分逆轉山楂多糖提取物胃癌細胞AGS增殖和凋亡的影響（n=3）/x ± s

2.6 Wnt/

β

-catenin 信號通路相關蛋白的表達

與對照組相比，山楂多糖提取物組胃癌細胞AGS 中βcatenin 表達水平降低（P ＜0.05）；與anti-miR-NC+山楂多糖提取物組相比，anti-miR-146a-5p+山楂多糖提取物組胃癌細胞AGS 中β-catenin 表達水平升高（P ＜0.05）。見圖4，表4。

圖3 低表達miR-146a-5p對cyclinD1、cleaved-caspase-3蛋白表達的影響

圖4 β-catenin蛋白的表達

表4 Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的表達（n=3）/x ± s

3 討論

研究發現中醫藥在癌前病變、術前新輔助化療、術后化療、延長患者生存期等方面對治療胃癌有較好療效。山楂是一種純天然的藥食同源的植物果實，其提取物具有抗氧化和延長壽命作用。山楂黃酮提取物也能夠有效地抑制癌細胞的生長。研究顯示山楂原花青素提取物可抑制肝癌SMMC-7721 細胞增殖，促進細胞凋亡。山楂多糖提取物可誘導人結腸癌細胞凋亡。本研究顯示，不同濃度山楂多糖提取物處理的胃癌細胞AGS中細胞增殖率降低，細胞凋亡率升高，cleaved-caspase-3表達水平升高。說明山楂多糖提取物可抑制胃癌細胞增殖，促進細胞凋亡。

研究表明miRNA 也參與調控癌癥的進展，miR-146a-5p 在轉移性前列腺癌組織中低表達，miR-146a-5p 過表達可誘導非雄激素依賴性前列腺癌細胞的凋亡。miR-146a-5p 過表達抑制非小細胞肺癌細胞的腫瘤發生和血管生成。本研究顯示，高表達miR-146a-5p 后胃癌細胞AGS 的增殖率降低，凋亡率升高，說明高表達miR-146a-5p 可抑制胃癌細胞增殖，促進細胞凋亡。表明miR-146a-5p 在胃癌中起抑癌作用。還有研究發現隱丹參酮通過調控miR-146a-5p/表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）軸抑制非小細胞肺癌。本研究顯示，山楂多糖提取物處理后，miR-146a-5p 表達水平升高，而低表達miR-146a-5p 部分逆轉了山楂多糖提取物對胃癌細胞AGS 增殖和凋亡的影響。說明山楂多糖提取物可能通過上調miR-146a-5p抑制胃癌細胞增殖，促進細胞凋亡。

Wnt/β-catenin信號通路參與調控癌癥達發生發展等過程，且與胃癌的進展有關。研究報道沉默β-catenin 可促進胃癌MGC-803 細胞凋亡，抑制其侵襲。漢黃芩素可通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路抑制胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移，并誘導細胞凋亡。本實驗結果顯示，山楂多糖提取物處理的胃癌細胞AGS 中β-catenin 表達水平降低，說明山楂多糖提取物可抑制Wnt/β-catenin 信號通路激活。而低表達miR-146a-5p 逆轉了山楂多糖提取物對βcatenin 表達的抑制作用。說明山楂多糖提取物可能通過調控miR-146a-5p 進而調控β-catenin 的表達而影響胃癌細胞增殖和凋亡。

綜上所述，山楂多糖提取物可能通過上調miR-146a-5p進而抑制Wnt/β-catenin信號通路激活而抑制胃癌細胞AGS 增殖，促進細胞凋亡。將可為中藥多糖治療胃癌提供了新思路。