微小RNA-212調(diào)控TOB2蛋白表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)化因子-β1干預(yù)A549細(xì)胞誘導(dǎo)肺纖維化及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

靳立振，趙永華，于巧青

作者單位：廊坊市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，河北 廊坊065000

肺纖維化是一種肺間質(zhì)性疾病，研究顯示上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transitions，EMT）是引發(fā)肺纖維化的主要原因，EMT 發(fā)生過程涉及轉(zhuǎn)化因子-β1（transforming growth factor-β1，TGFβ1）等多種細(xì)胞因子，TGFβ1 可通過誘導(dǎo)EMT 發(fā)生從而促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，同時(shí)可通過抑制蛋白水解酶生成而促使細(xì)胞外基質(zhì)沉積從而引發(fā)肺纖維化。研究表明微小RNA（microRNA，miRNA）在TGFβ1 干預(yù)后的肺泡上皮A549 細(xì)胞中表達(dá)異常，并可能參與肺纖維化形成過程。因而探尋新型miRNA 分子并探究其在肺纖維化形成過程中的作用機(jī)制具有重要意義。研究表明微小RNA-212（microRNA-212，miR-212）表達(dá)異常與炎癥反應(yīng)、免疫缺陷疾病及慢性腎病等相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miR-212 還可促進(jìn)二氧化硅（SiO）誘導(dǎo)的EMT 過程。但miR-212 在肺纖維化發(fā)生過程中的作用機(jī)制尚未可知。Targetscan 預(yù)測顯示TOB2 可能是miR-212 的靶基因，TOB2 過表達(dá)可抑制肺上皮細(xì)胞EMT 過程及遷移能力。但miR-212是否可通過調(diào)控TOB2 表達(dá)從而參與肺纖維化過程尚未可知。本研究自2018 年3 月至2019 年3 月在TGFβ1 干預(yù)A549 細(xì)胞中檢測miR-212、TOB2 的表達(dá)變化，初步分析其在肺纖維化發(fā)生過程中的可能作用，為進(jìn)一步探討肺纖維化形成機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肺泡上皮A549 細(xì)胞（美國ATCC 公司）。TGFβ1（美國PeproTech 公司）；RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（均為美國Hyclone 公司）；Lipofectamine2000（美國Thermo Fisher公司）；miR-212 抑制劑（anti-miR-212）及其陰性對(duì)照（anti-miR-con）、miR-212 模擬物（mimics）及陰性對(duì)照mimic NC 序列（miR-con）、TOB2 小干擾RNA（si-TOB2）及無意義序列（si-con）（均為上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；甲基噻唑基四唑（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）（上海澤葉生物科技有限公司）；雙熒光素酶報(bào)告基因載體（美國Promega 公司）及活性檢測試劑盒（美國Promega 公司）；細(xì)胞周期蛋白1（CyclinD1）（美國Santa Cruz 公司）、TOB2 單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；波形蛋白（Vimentin）、α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、I型膠原蛋a1（COL1a1）、上皮鈣黏附素（E-cadherin）（均為美國Epitomics 公司）；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒與實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（均為大連寶生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞來源及培養(yǎng)條件 人肺泡上皮A549 細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件：37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳培養(yǎng)箱，待細(xì)胞生長融合度達(dá)到70%時(shí)用不含血清的培養(yǎng)基饑餓處理24 h。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法分成6組：PBS組（用普通培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h）、TGFβ1 組（含有5 ng/mLTGFβ1 培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h）、TGFβ1+anti-miR-con組（轉(zhuǎn)染anti-miR-con 后使用含有5 ng/mLTGFβ1 培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h）、TGFβ1+anti-miR-212 組（轉(zhuǎn)染antimiR-212 后使用含有5 ng/mLTGFβ1 培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h）、TGFβ1+ anti-miR-212+si-con 組（共 轉(zhuǎn) 染antimiR-212 與si-con 后使用含有5 ng/mLTGFβ1 培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h）、TGFβ1+anti-miR-212+si-TOB2 組（共轉(zhuǎn)染anti-miR-212與si-TOB2后使用含有5 ng/mLTGFβ 1培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h）。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測細(xì)胞中miR-212、TOB2 mRNA 表達(dá)水平 采用Trizol 法提取各組細(xì)胞總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計(jì)測定RNA 濃度，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列見表1。配置qRT-PCR 反應(yīng)體系，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，反應(yīng)條件：95 ℃2 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，循環(huán)40 次，miR-212 以U6 為內(nèi)參，TOB2以β-actin 為內(nèi)參，采用2法計(jì)算miR-212、TOB2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 MTT 檢測細(xì)胞增殖 收集對(duì)數(shù)生長期A549細(xì)胞，胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10個(gè)/毫升，接種于96 孔板（100 微升/孔），置于溫度37 ℃、相對(duì)濕度95%、體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，棄按照“1.2.1”處理，每孔加入20 μL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO），振蕩混勻，利用酶標(biāo)儀檢測波長為490 nm處各孔吸光度（OD）值，細(xì)胞增殖率（%）= 實(shí)驗(yàn)組/空白組×100%。

1.2.5 熒光素酶報(bào)告基因檢測 將熒光素酶報(bào)告載體WT- TOB2、MUT- TOB2 分別與miR-212 mimics、miR-NC 共轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h 后收集細(xì)胞，根據(jù)熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性（螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值）。

1.2.6 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測CyclinD1、Vimentin、α-SMA、COL1a1、E-cadherin 蛋 白 表 達(dá)收集各組細(xì)胞，加入蛋白裂解液，4 ℃條件下12 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min（離心半徑6 cm）提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白，蛋白上樣量30微克/孔，轉(zhuǎn)膜，BSA 封閉1 h，加入蛋白一抗，TBST洗滌，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌，ECL 顯色，曝光，顯影，采用Quantity One 軟件檢測條帶灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參照條帶灰度值。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。結(jié)果均為正態(tài)計(jì)量資料，以x ± s 表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-

β

1 對(duì)A549 細(xì)胞中的miR

-

212 和TOB2表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于PBS組，TGFβ1組A549 細(xì)胞中miR-212 的表達(dá)水平顯著升高（P ＜0.05），而TOB2 mRNA 及蛋白表達(dá)水平顯著降低（P ＜0.05），見表2。

表2 TGFβ1對(duì)A549細(xì)胞中miR-212和TOB2的表達(dá)（n=9）/x ± s

2.2 干擾miR-212 抑制TGF

β

1 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞增殖的影響

與PBS組相比，TGFβ1組A549細(xì)胞增殖率顯著升高（P ＜0.05），細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白CyclinD1的表達(dá)水平顯著升高（P ＜0.05）；相較于TGFβ1+antimiR-con 組，TGFβ1+anti-miR-212 組A549 細(xì)胞增殖率顯著降低（P ＜0.05），細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P ＜0.05），見表3。

表3 干擾miR-212抑制TGFβ1誘導(dǎo)A549細(xì)胞增殖和CyclinD1的表達(dá)（n=9）/x ± s

2.3 干 擾miR-212 抑 制TGF

β

1 誘 導(dǎo)A549 細(xì) 胞EMT 和COL1a1 蛋白表達(dá)

與PBS 組相比，TGFβ1組A549 細(xì)胞中EMT 間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin、α-SMA、及纖維化標(biāo)記蛋白COL1a1 的表達(dá)水平均顯著升高（P ＜0.05），EMT 上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低（P ＜0.05）；與TGFβ1+antimiR-con 組相比，TGFβ1+anti-miR-212 組A549 細(xì)胞中EMT 間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin、α-SMA 及纖維化標(biāo)記蛋白COL1a1 的表達(dá)水平均顯著降低（P ＜0.05），EMT 上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P ＜0.05），見圖1、表4。

圖1 檢測A549細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin、α-SMA和COL1a1蛋白表達(dá)

2.4 miR-212 靶 向 調(diào) 控TOB2 表 達(dá)

Targetscan預(yù)測到miR-212 靶向TOB2。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-TOB2 的miR-212 組熒光素酶活性顯著低于miR-con 組（P ＜0.05），共轉(zhuǎn)染MUT-TOB2 的miR-212 組與miR-con 組熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表5。Western blot 檢測結(jié)果顯示，與miR-con 組相比，miR-212 組A549 細(xì)胞中TOB2 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P ＜0.05）；與anti-miR-con 組相比，antimiR-212 組A549 細(xì)胞中TOB2 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P ＜0.05），見圖2、表6。

圖2 蛋白免疫印跡檢測結(jié)果

2.5 下 調(diào)TOB2 和 干 擾miR

-

212 對(duì)TGF

β

1 誘 導(dǎo)A549細(xì)胞增殖、EMT和纖維化的影響

相較于TGFβ 1+ anti-miR-212+si-con 組，TGFβ1+ anti-miR-212+si-TOB2組A549細(xì)胞增殖率顯著升高（P ＜0.05），細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白CyclinD1與EMT間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin、α-SMA及纖維化標(biāo)記蛋白COL1a1的表達(dá)水平顯著升高（P ＜0.05），EMT上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低（P ＜0.05），見圖3，表7。

3 討論

肺纖維化發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但研究報(bào)道指出遺傳因素與氧化應(yīng)激等可能引發(fā)肺纖維化，其主要病理特點(diǎn)為肺泡上皮細(xì)胞損傷與修復(fù)處于失衡狀態(tài)導(dǎo)致肺功能逐漸喪失，隨著疾病惡性進(jìn)展可造成患者因呼吸衰竭而死亡。肺泡上皮細(xì)胞惡性增殖、肺泡炎及成纖維細(xì)胞增殖等均可參與肺纖維化形成過程。已有報(bào)道指出miRNA 在肺纖維化形成過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。因此本研究尋找miRNA 并分析其在肺纖維化發(fā)生中的分子機(jī)制，為肺纖維化的防治提供新方向。

表4 干擾miR-212抑制TGFβ1誘導(dǎo)A549細(xì)胞EMT和COL1a1蛋白表達(dá)（n=9）/x ± s

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（n=9）/x ± s

表6 miR-212靶向TOB2調(diào)控其表達(dá)（n=9）/x ± s

圖3 檢測A549細(xì)胞中CyclinD1、E-cadherin、Vimentin、α-SMA和COL1a1蛋白表達(dá)

miR-212 與miR-132 結(jié)構(gòu)相同并具有相似生物學(xué)功能，研究表明miR-212 在多種炎癥性疾病中呈高表達(dá)，并可能參與腫瘤、神經(jīng)等相關(guān)性疾病發(fā)生發(fā)展過程。但miR-212 在肺纖維化中的表達(dá)變化尚未可知。本研究通過TGF-β1 誘導(dǎo)肺泡上皮A549 細(xì)胞擬構(gòu)建肺纖維化模型，結(jié)果顯示TGF-β1處理后A549 細(xì)胞中miR-212 的表達(dá)水平顯著升高，提示miR-212 表達(dá)量增加可能促進(jìn)肺纖維化發(fā)生。本研究進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)干擾miR-212表達(dá)可顯著降低TGF-β1 誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞增殖率，并可抑制CyclinD1 表達(dá)，說明干擾miR-212 表達(dá)可抑制TGFβ1誘導(dǎo)A549 細(xì)胞增殖。研究報(bào)道指出CyclinD1 可正向調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。提示干擾miR-212 表達(dá)可能通過抑制CyclinD1 表達(dá)而抑制A549細(xì)胞增殖從而抑制肺纖維化發(fā)展進(jìn)程。研究表明TOB2 屬于抗細(xì)胞增殖基因，腦損傷發(fā)生時(shí)TOB2 表達(dá)水平降低導(dǎo)致機(jī)體炎癥細(xì)胞分泌量增加從而加重腦組織損傷程度，若增加TOB2 表達(dá)量可減少炎癥細(xì)胞增殖分化從而減輕腦組織內(nèi)炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示TGF-β1處理后可顯著降低A549細(xì)胞中TOB2 的表達(dá)，說明TOB2 表達(dá)量降低可能引發(fā)肺部炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肺纖維化發(fā)生。本研究試圖分析miR-212與TOB2的相關(guān)性，通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-212可靶向調(diào)控TOB2的表達(dá)，進(jìn)一步研究顯示下調(diào)TOB2 表達(dá)可逆轉(zhuǎn)干擾miR-212 對(duì)TGFβ1 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞增殖的抑制作用，提示干擾miR-212 表達(dá)可通過上調(diào)TOB2 的表達(dá)抑制TGFβ1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞增殖。

表7 下調(diào)TOB2和干擾miR-212對(duì)TGFβ1誘導(dǎo)A549細(xì)胞增殖、EMT和纖維化的影響（n=9）/x ± s

肺纖維化發(fā)生早期可促進(jìn)前炎性介質(zhì)、趨化因子表達(dá)，TGFβ1 可通過促進(jìn)EMT 轉(zhuǎn)化從而促進(jìn)肺纖維化惡性進(jìn)展。EMT 表現(xiàn)為上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其中上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin 表達(dá)降低，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin表達(dá)升高，α-SMA作為間葉標(biāo)記物可用于評(píng)價(jià)EMT 轉(zhuǎn)化。COL1a1 表達(dá)量升高可作為成纖維細(xì)胞增多或纖維化的有效標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示TGFβ1 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞中Vimentin、α-SMA、COL1a1 蛋白表達(dá)量顯著增加，Ecadherin 蛋白表達(dá)量顯著降低，說明TGFβ1 可促進(jìn)A549 細(xì)胞EMT 轉(zhuǎn)化進(jìn)程。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)干擾miR-212 表 達(dá) 后 可 顯 著 降 低Vimentin、α-SMA、COL1a1 蛋白表達(dá)，而促進(jìn)E-cadherin 蛋白表達(dá)，但下調(diào)TOB2 的表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)干擾miR-212 表達(dá)對(duì)TGFβ1 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞EMT 及纖維化。提示干擾miR-212 表達(dá)可通過上調(diào)TOB2 的表達(dá)從而抑制TGFβ1誘導(dǎo)A549細(xì)胞EMT及纖維化。

綜上所述，miR-212 在TGFβ1 干預(yù)A549 細(xì)胞中呈高表達(dá)，TOB2 表達(dá)水平降低，干擾miR-212 表達(dá)可通過促進(jìn)TOB2 的表達(dá)而抑制TGFβ1 誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞纖維化及EMT 轉(zhuǎn)化進(jìn)程，可為肺纖維化的防治提供潛在靶點(diǎn)。但關(guān)于其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。