CYP2B6基因多態(tài)性與成年人急性髓系白血病易感性的相關(guān)性

陳宗云，葉曉藝，王若濤，郭建峰

福建醫(yī)科大學(xué)附屬閩東醫(yī)院:1.檢驗(yàn)科;2.腎內(nèi)科，福建寧德 355000

急性髓系白血病(AML)是成年人最常見(jiàn)的急性白血病類型，是急性白血病中發(fā)病最多且患者生存率最低的異質(zhì)性疾病[1-2]。有研究顯示，AML在全球范圍的發(fā)病率為1.62/10萬(wàn)，我國(guó)AML的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[3]。AML發(fā)病機(jī)制目前還不清楚，可能的原因是環(huán)境暴露和遺傳易感性之間的相互作用。參與藥物吸收、分布、代謝、排泄(ADME)的基因存在顯著的個(gè)體及地域差異，與許多疾病的易感性有關(guān)[4]。大多數(shù)ADME基因?qū)儆诩?xì)胞色素P450(CYP450)家族，編碼最重要的代謝同工酶，這些同工酶負(fù)責(zé)大多數(shù)異生物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化。CYP2B6是CYP450家族中重要的藥物代謝酶，CYP2B6的基因多態(tài)性導(dǎo)致對(duì)毒性物質(zhì)處理的個(gè)體差異可能是白血病易感性的影響因素之一[5]。己發(fā)現(xiàn)CYP2B6單核苷酸多態(tài)性(SNP)不同位點(diǎn)，如G516T、C65T、C777A、A785G、C1459T、T983C[6-7]。YUAN等[8]的研究顯示，北方人群急性AML患者CYP2B6 516G>T(rs3745274)位點(diǎn)具有更高的GT基因型頻率，這可能是導(dǎo)致急性白血病易感性的重要遺傳因素。而對(duì)于南方人群，并沒(méi)有詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)，而且未見(jiàn)國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)CYP2B6 785A>G(rs2279343)位點(diǎn)的研究。本研究旨在探討南方人群CYP2B6 516G>T、CYP2B6 785A>G兩個(gè)SNP位點(diǎn)與AML易感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2016—2019年在福建醫(yī)科大學(xué)附屬閩東醫(yī)院血液科確診的87例AML患者作為AML組，其中女41例、男46例，年齡(62.3±13.6)歲；另外，選取同期于本院體檢的健康體檢者191例作為對(duì)照組，其中女93例、男98例，年齡(62.4±11.8)歲；以上所選研究對(duì)象均無(wú)血緣關(guān)系。AML組與對(duì)照組間性別構(gòu)成、年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并在研究開(kāi)始前獲得患者或家屬的書(shū)面同意。

1.2儀器與試劑 TD5A-WS型臺(tái)式低速離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)、ETC811型基因擴(kuò)增儀、QT-1型漩渦混合器(上海琪特分析儀器有限公司)、Mini-4lc型微型離心機(jī)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)、凝膠成像儀(上海培清科技有限公司)、FR-250型電泳儀(上海復(fù)日科技有限公司)；ABI3730XL型全自動(dòng)DNA測(cè)序儀(賽默飛世爾公司)；全血基因組DNA提取試劑盒(亞能生物公司)；PCR擴(kuò)增試劑、引物由福州尚亞生物技術(shù)有限公司合成。

1.3方法

1.3.1基因組DNA提取 在無(wú)菌條件下抽取研究對(duì)象外周靜脈血或骨髓液2 mL，待血液與抗凝劑充分混勻，采用全血基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

1.3.2引物設(shè)計(jì)與合成 用在線軟件Primer3設(shè)計(jì)用于CYP2B6 785A>G、CYP2B6 516G>T兩個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)的引物。見(jiàn)表1。

表1 SNP位點(diǎn)的引物序列

1.3.3PCR擴(kuò)增目的基因片段 PCR擴(kuò)增體系為50.0 μL，含2×PCR Mix 25.0 μL，上游、下游引物各1.0 μL，模板DNA 4.0 μL。PCR循環(huán)條件：94 min；94 ℃ 45 s、58 ℃ 45 s、68 ℃ 55 s，30個(gè)循環(huán)；68 ℃ 5 min；取PCR產(chǎn)物5.0 μL，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.4PCR產(chǎn)物直接測(cè)序 取1.0 μL純化后的產(chǎn)物，與0.5 μL GeneScanTM120 LIZ標(biāo)準(zhǔn)品，8.5 μL Hi-DiTM甲酰胺混勻，95 ℃變性5 min后于測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)序儀上收集的原始數(shù)據(jù)用chromas軟件讀取測(cè)序圖譜并進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1AML組與對(duì)照組部分常規(guī)血液檢測(cè)指標(biāo)的比較 AML組外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)水平高于對(duì)照組(P<0.05)；AML組外周血血紅蛋白(Hb)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)水平低于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組常規(guī)血液檢測(cè)指標(biāo)的比較

2.2CYP2B6 785A>G、CYP2B6 516G>T兩個(gè)位點(diǎn)基因型 利用Sanger測(cè)序?qū)YP2B6 785A>G、516G>T位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，結(jié)果顯示785A>G位點(diǎn)有3種基因型：AA、AG、GG，516G>T位點(diǎn)有3種基因型：GG、GT、TT。

2.3CYP2B6 785A>G、516G>T基因多態(tài)性與AML患病風(fēng)險(xiǎn)的分析 本研究中CYP2B6 785A>G位點(diǎn)的3種基因型AA、AG、GG的分布頻率在對(duì)照組中分別為69.3%、28.4%、2.3%，在AML組中分別為53.2%、35.4%、13.4%。CYP2B6 516G>T位點(diǎn)3種基因型GG、GT、TT的分布頻率在對(duì)照組中分別為57.1%、38.7%、4.2%，在AML組中分別為65.7%、32.2%、2.3%。CYB2B6 785A>G、516G>T位點(diǎn)基因型在對(duì)照組人群中的分布符合哈迪-溫伯格平衡定律(P>0.05)，表明所選研究人群具有群體代表性。若CYP2B6 785A>G位點(diǎn)的基因型為顯性模型(攜帶G的基因型)會(huì)增加AML的患病風(fēng)險(xiǎn)(AG+GGvs.AA，P<0.05，OR=5.34，95%CI：4.05～7.04)，等位基因G會(huì)增加AML患病風(fēng)險(xiǎn)(Gvs.A，P<0.05，OR=2.22，95%CI：1.46～3.37)。CYP2B6 516G>T位點(diǎn)的基因型是否為顯性模型(攜帶T的基因型)與AML患病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)(GT+TTvs.GG，P>0.05，OR=0.70，95%CI：0.41～1.19)，等位基因類型與AML風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)(Gvs.T，P>0.05，OR=0.73，95%CI：0.47～1.15)。見(jiàn)表3。

表3 CYP2B6 785A>G、516G>T基因多態(tài)性與AML的相關(guān)性分析

3 討 論

CYP450又稱肝微粒體混合功能氧化酶，主要參與藥物體內(nèi)Ⅰ相代謝反應(yīng)，負(fù)責(zé)許多藥物的生物轉(zhuǎn)化。CYP450廣泛存在于肝、腸、皮膚、鼻上皮、肺、腎等部位[9]。CYP450超家族基因多態(tài)性對(duì)于包括藥物、毒物和致癌物在內(nèi)的許多物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化有非常重要的影響[10]。CYP2B6是CYP450家族中重要的藥物代謝酶，參與多種內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的合成和代謝[11]。CYP2B6基因定位在19q1—13.2，全長(zhǎng)28 kb，包含9個(gè)外顯子，編碼的蛋白質(zhì)由491個(gè)氨基酸組成。CYP2B6基因有高度多態(tài)性，有38個(gè)已知的變異等位基因和多個(gè)亞等位基因。其中，CYP2B6 516G>T、785A>G遺傳多態(tài)性在中國(guó)漢族人群中較為常見(jiàn)，其突變率為18.4%[12]。致癌物代謝酶的多態(tài)性可能影響酶活性，進(jìn)而導(dǎo)致原癌基因激活或失活。已知CYP1A1、CYP2D6、CYP2E1的幾種SNP位點(diǎn)基因型是急性白血病的危險(xiǎn)因素[13-14]。近年來(lái)CYP2B6多態(tài)性的研究主要集中在對(duì)抗腫瘤藥物環(huán)磷酰胺、止痛藥物美沙酮、抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物依法韋侖等的藥物動(dòng)力學(xué)影響方面[15-18]。CYP2B6多態(tài)性與急性白血病易感性的關(guān)系尚未得到充分的研究。

CYP2B6 785A>G是第5外顯子中的單核苷酸被替換，會(huì)導(dǎo)致在第262位的氨基酸(精氨酸)發(fā)生賴氨酸替換，并通過(guò)改變底物結(jié)合位點(diǎn)或選擇性剪接來(lái)影響代謝活動(dòng)[19]。JUSTENHOVEN等[20]研究提示，CYP2B6 785A>G在顯性模型下會(huì)增加乳腺癌患病患病風(fēng)險(xiǎn)。KUROSAKI等[21]研究提示，CYP2B6 785A>G位點(diǎn)的等位基因G會(huì)增加前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)。這些研究說(shuō)明CYP2B6基因多態(tài)性與腫瘤易感性有關(guān)。DARAKI等[22]的研究提示，CYP2B6 785A>G位點(diǎn)的等位基因G會(huì)增加AML的患病風(fēng)險(xiǎn)。本研究的結(jié)果與上述研究相似。

CYP2B6 516G>T是第4外顯子的單核苷酸被替換，進(jìn)而導(dǎo)致在第172位的氨基酸(谷氨酰胺)發(fā)生組氨酸替換,從而使CYP2B6活性顯著降低，并通過(guò)異常剪接影響代謝活性，導(dǎo)致正常mRNA轉(zhuǎn)錄物的水平降低，因此降低了功能性蛋白質(zhì)的水平[23]。BERKOZ等[24]研究表明，CYP2B6 516G>T在顯性模型下會(huì)增加AML的患病風(fēng)險(xiǎn)，等位基因T會(huì)增加AML的患病風(fēng)險(xiǎn)。DARAKI等[25]的研究也提示，CYP2B6 516G>T位點(diǎn)的等位基因T會(huì)增加AML患病風(fēng)險(xiǎn)。本研究的結(jié)果顯示，CYP2B6 516G>T位點(diǎn)的T等位基因與AML發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)，與上述報(bào)道不一致，可能與研究的樣本量較小以及研究對(duì)象的遺傳背景不同有關(guān)。

綜上所述，CYP2B6 785A>G位點(diǎn)在顯性模型下及等位基因G均會(huì)增加AML患病風(fēng)險(xiǎn)。CYP2B6 516G>T位點(diǎn)在顯性模型下及等位基因T均與AML風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)。