DNA微陣列芯片法在海南地區結核病診斷及耐藥性檢測中的應用

馮所遠，陳灼霖，符史健，鐘業騰△

1.海口市第四人民醫院重癥醫學科，海南海口 571100；2.海南醫學院第二附屬醫院檢驗科，海南海口 570311

結核病是由結核分枝桿菌(MTB)感染引起的一種嚴重危害人類健康的慢性傳染性疾病[1]。據2019年世界衛生組織(WHO)報道，我國結核病患者數量僅次于印度，占全球的9%；2018年全球約有48.4萬新發耐利福平結核病，我國占14%，遠超全球平均水平[2]。耐藥結核病疫情形勢嚴峻，全球結核病防控工作面臨挑戰[3]。早發現、早治療是減少結核發病及傳播的重要途徑[4]，但截至2015年年底，我國結核病的病原學檢出率僅為33%，明顯低于《“十三五”全國結核病防治規劃》中要求的50%[5]。這與臨床實驗室診斷技術水平滯后有關，當前各級醫療機構主要使用的檢測方法是痰涂片與傳統的細菌培養加藥敏試驗，前者雖價格低廉但靈敏度低，后者雖為診斷金標準但耗時過長，無法滿足臨床快速診斷的需求[6]，有可能造成MTB耐藥株的傳播。因此，當前控制結核病疫情的關鍵在于盡快建立早期快速診斷MTB感染及其耐藥性檢測的技術。WHO及我國先后把分子生物學診斷納入結核病診斷標準[7]。DNA微陣列芯片法(以下簡稱為“DNA芯片法”)是通過檢測標本中MTB及其相關耐藥基因的突變，從而判定是否感染MTB及其對利福平和異煙肼耐藥性的一種分子生物學診斷技術，可在6～8 h得到結核病診斷及耐藥性檢測結果。雖然國內很多文獻報道了關于DNA芯片法在結核病診斷中的應用，但是應用大樣本量的痰標本直接評估DNA芯片法在MTB診斷和耐藥性檢測中的應用還很少[8-9]，且不同地區MTB耐藥基因突變位點也存在差異。本研究主要采用DNA芯片法對海南地區疑似結核病患者的痰標本進行了檢測，探討了DNA芯片法在海南地區結核病診斷及耐藥性檢測中的應用價值，同時分析海南地區MTB耐藥基因的特征。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2017年1月至2019年12月于海南醫學院第二附屬醫院和海口市第四人民醫院就診2 069例疑似結核病患者納入研究。其中男性1 566例，年齡(53.3±16.2)歲；女性503例，年齡(50.3±18.0)歲。

1.2儀器與試劑 MTB DNA提取試劑、MTB耐藥基因檢測試劑盒(DNA芯片法)、核酸快速提取儀、芯片洗干儀、芯片雜交儀和微陣列芯片掃描儀等均購自北京博奧公司；酸性羅氏培養基、比例法藥敏試驗相關試劑、硝基苯甲酸(PNB)/噻吩-2-羧酸肼(TCH)培養基和抗酸染色液均購自珠海貝索公司；BSC-1600ⅡB2型生物安全柜購自蘇州安泰公司。MTB H37Rv(ATCC27294)標準株由中國疾病預防控制中心結核病參比實驗室提供。

1.3方法

1.3.1標本預處理和抗酸桿菌涂片染色 每例患者分別留取隨機、晚上及早上3份痰標本，每份痰標本至少2 mL；檢測時，吸取每例患者的2份質量較好的痰標本各1 mL進行混合，共得到2 069份痰標本。痰標本按照《結核病實驗室檢驗規程》[1]要求進行涂片抗酸染色鏡檢。再加入1～2倍體積的4% NaOH溶液，然后振蕩混勻，室溫靜止15 min，制成預處理痰標本。

1.3.2MTB的分離培養鑒定及藥敏試驗 按照《結核病實驗室檢驗規程》[1]要求進行試驗，預處理痰標本采用羅氏培養法進行分離培養；培養陽性的菌株采用PNB/TCH培養基進行初步菌種鑒定；采用WHO推薦的比例法對利福平(40 μg/mL)和異煙肼(0.2 μg/mL)進行MTB的藥敏試驗。

1.3.3DNA芯片法 吸取1 mL預處理痰標本上清液于1.5 mL微量離心管中，按照MTB耐藥基因檢測試劑盒使用說明書操作，制備成核酸提取物。吸取所得核酸提取物2 μL依次加入到3個分別預先分裝好18 μL PCR擴增試劑的1、2、3號PCR管中，放入基因擴增儀中進行擴增，所得到PCR產物經變性后嚴格按照試劑盒說明書要求進行PCR產物點樣、雜交及芯片洗干、芯片掃描分析，在晶芯MTB藥敏檢測分析系統進行信號分析及結果判斷。

1.4質量控制 涂片陽性標本中培養陽性(涂陽培陽)率不低于90%，培養污染率應小于5%；海南醫學院第二附屬醫院結核病實驗室每年參加中國疾病預防控制中心結核病參比實驗室和結核病防治臨床中心的抗酸桿菌涂片檢查、分枝桿菌分離培養、抗結核藥敏試驗及結核病分子技術室間質量評價活動。

1.5統計學處理 用SPSS20.0軟件進行數據分析，采用配對四方格χ2檢驗評估兩種方法的差異性，P<0.05為差異有統計學意義；兩種方法檢測結果的一致性檢驗用Kappa檢驗判別，當Kappa≥0.75，一致性較好；當Kappa為0.4～<0.75，一致性一般；當Kappa<0.4，一致性較差[10]。

2 結 果

2.1痰標本的檢測情況 在2 069份痰標本中，抗酸桿菌涂片陽性率為30.3%(626/2 069)；分離培養陽性率為45.6%(944/2 069)，涂陽培陽率為90.7%(568/626)，污染率為0.2%(4/2 069)；符合痰培養質控要求。所有痰標本分別經PNB/TCH培養基鑒定和DNA芯片法菌種基因鑒定共檢測出1 054份單獨MTB感染、131份單獨非結核分枝桿菌(NTM)和7份MTB+NTM混合感染的痰標本。剔除131份單獨NTM感染、7份MTB+NTM混合感染、4份培養污染和8份DNA芯片法檢測信號異常痰標本，共有1 919份痰標本納入本研究分析。

2.2DNA芯片法與兩種傳統方法檢測MTB的比較 在納入研究分析的1 919份痰標本中，采用DNA芯片法、羅氏培養法和抗酸桿菌涂片法檢測MTB的陽性率分別為46.9%(900/1 919)、42.4%(814/1 919)和29.5%(567/1 919)。DNA芯片法分別與羅氏培養法比較、抗酸桿菌涂片法比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 DNA芯片法與兩種傳統方法檢測MTB的比較

2.3DNA芯片法與比例法檢測MTB耐藥性的比較

2.3.1DNA芯片法與比例法檢測MTB耐藥性的比較 對720份DNA芯片法與羅氏培養法同為陽性的痰標本采用DNA芯片法和比例法進行MTB的耐藥性檢測，以比例法為金標準。DNA芯片法與比例法檢測MTB對耐利福平、異煙肼的耐藥性的結果比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，但均具有較好一致性(Kappa≥0.75)，見表2。

表2 DNA芯片法與比例法檢測MTB耐藥性的比較

2.3.2兩種方法檢測MTB多重耐藥(MDR)的結果比較 DNA芯片法與比例法檢測多重耐藥結核(MDR-TB)的結果比較，差異有統計學意義(P<0.05)，但具有較好一致性(Kappa=0.778)，以比例法為金標準，靈敏度為76.41%，特異度為97.33%，符合率為91.67%。見表3。

表3 DNA芯片法與比例法檢測MDR-TB的比較分析

2.4DNA芯片法檢測MTB耐藥基因突變位點 耐利福平突變菌株主要基因突變位點為rpoB531，占58.2%(156/268)；其中主要突變類型為C→T，占56.3%(151/268)。耐異煙肼突變菌株主要基因突變位點為KatG315，占89.7%(175/195)；其中主要突變類型為G→C,占84.6%(165/195)。MDR-TB耐藥基因突變位點主要為rpoB531+KatG315，占54.6%(89/163)。見表4、5。

表4 DNA芯片法檢測MTB耐藥基因突變位點分布情況

續表4 DNA芯片法檢測MTB耐藥基因突變位點分布情況

表5 DNA芯片法檢測MDR-TB的耐藥基因突變位點分布情況

3 討 論

歷年的海南地區流行病學調查顯示，該地區結核病患者數量一直處于全國前列[11-12]，這主要跟當地的歷史、經濟、文化有關，該地區臨床實驗室篩查結核病的方法主要還是痰涂片與傳統的培養和藥敏試驗，這已無法滿足結核病診斷和治療的需求。DNA芯片法作為一種分子生物學診斷技術，近年來在我國已廣泛地應用于結核病的診斷和治療，有相關文獻報道DNA芯片法檢測MTB有較高的特異度和靈敏度[13]。本研究采用DNA芯片法直接檢測痰標本中MTB及其相關耐藥基因，這縮短了MTB診斷及其耐藥性檢測的時間。本研究對1 919份痰標本的分析發現，DNA芯片法檢測MTB的陽性率為46.9%，明顯高于趙靜等[14]的報道，其檢測MTB的陽性率明顯高于羅氏培養法和抗酸桿菌涂片法，這表明DNA芯片法在結核病患者痰標本MTB的診斷中有較高的應用價值，有助于提高MTB的檢出率。

本研究發現，以比例法為金標準，DNA芯片法檢測耐利福平、異煙肼MTB及MDR-TB的特異度分別為93.29%、97.73%、97.33%，靈敏度分別為97.12%、77.97%和76.41%，符合率為94.58%、91.25%、91.67%，其中耐利福平、異煙肼MTB及MDR-TB檢測的特異度和符合率與趙冰等[15]、陳林等[16]的報道相近，但耐利福平MTB檢測的靈敏度明顯高于文獻報道，而耐異煙肼MTB及MDR-TB檢測靈敏度則均低于文獻報道，這可能是海南地區的MTB耐利福平及異煙肼相關基因突變特征與文獻所報道地區不同有關，也可能與本研究為大樣本量研究有關。本研究中，DNA芯片法對痰標本MTB的耐利福平基因檢測靈敏度比耐異煙肼和MDR-TB效果好，這可能是因為本研究所使用的DNA芯片檢測試劑盒所能檢測的耐異煙肼基因突變位點不夠全面，未能覆蓋海南地區MTB常見的耐異煙肼基因突變位點。有文獻報道，耐利福平MTB有95%以上是由rpoB基因突變所致[17-18]；耐異煙肼MTB耐藥株主要是由KatG(占45%～75%)和inhA(占15%～25%)基因突變引起的，但還存在一定比例耐異煙肼MTB是由ahpC和KasA等基因突變引起[19]；海南地區部分耐異煙肼MTB可能存在其他耐藥機制；不能排除痰標本中有多種耐藥類型的MTB耐藥株存在。而MDR-TB檢測效果較差也是受異煙肼耐藥株檢測效果影響所致。這說明DNA芯片法在結核病耐藥性檢測中還存在一定局限性，不能完全取代傳統藥敏試驗，但作為WHO推薦用于MDR-TB的快速分子診斷方法，本研究也發現了其在海南地區疑似結核病患者的痰標本MTB利福平、異煙肼耐藥性及MDR-TB檢測中均有較高特異度和靈敏度，是可以應用于海南地區臨床實驗室對耐藥結核的診斷或篩查。

本研究發現，海南地區MTB耐利福平基因突變類型主要是rpoB531(C→T)，而耐異煙肼基因突變類型主要是KatG315(G→C)，MDR-TB耐藥基因突變類型主要為rpoB531+KatG315，與許榕青等[20]的報道相近，明顯高于王丹吉等[9]的報道，這表明MTB相關耐藥基因突變導致的耐藥存在一定的地域差異，也說明海南地區的MTB耐利福平基因突變主要與rpoB上531密碼子突變有關，耐異煙肼基因突變主要與KatG上315密碼子發生突變有關，但也應注意有一定比例MTB耐藥株是inhA基因啟動子突變引起的對異煙肼的低水平耐藥。

本研究還從2 069份痰標本中發現131份單獨NTM感染和7份為NTM+MTB混合感染的患者，這顯示海南地區在防控結核病疫情中應注意鑒別NTM感染和NTM+MTB混合感染，在進行傳統抗酸桿菌涂片和羅氏培養時，容易受NTM干擾，無法鑒別是否存在MTB感染，且NTM對PNB/TCH和常用抗結核藥物具有高耐藥性的特征，容易引起臨床誤診、誤治[6]，而DNA芯片法可直接檢測患者標本中的MTB及其相關耐藥基因，可有效避免標本中NTM的干擾，可更快速、準確地對MTB及其相關耐藥基因進行檢測。

綜上所述，DNA芯片法在MTB檢測中具有快速、準確的特點，對臨床及時、準確地進行抗結核治療具有重要意義。