稽留流產(chǎn)與子宮蛻膜組織中PSG1 mRNA、BMP-2、Beclin-1 mRNA的相關(guān)性分析

龔凈嫻，劉 敏，楊 芳，田春艷，李 蓉

綿陽(yáng)市中心醫(yī)院：1.產(chǎn)科；2.婦科，四川綿陽(yáng) 621000；3.綿陽(yáng)市第三人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川綿陽(yáng) 621000

稽留流產(chǎn)又稱為過(guò)期流產(chǎn)或死胎不下[1]，胚胎停止發(fā)育后2個(gè)月尚未自然排出者為稽留流產(chǎn)。陰道流血及腹痛是稽留流產(chǎn)的常見(jiàn)癥狀，同時(shí)患者可伴有先兆流產(chǎn)癥狀。先兆流產(chǎn)若不及時(shí)處理，不僅影響患者健康，而且可能會(huì)影響患者再次生育[2]。為此，早期診斷并采取針對(duì)性措施顯得尤為重要。目前，關(guān)于稽留流產(chǎn)的病因并無(wú)定論，可能與生活環(huán)境、內(nèi)分泌水平、精神壓力、基因等因素有關(guān)[3]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，各種分子生物學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)為臨床疾病的診斷提供了新的方法。重組人妊娠特異性β1糖蛋白(PSG1)mRNA、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)、Beclin-1 mRNA是近年來(lái)研究較多的稽留流產(chǎn)相關(guān)指標(biāo)。有研究報(bào)道，稽留流產(chǎn)患者子宮蛻膜組織中PSG1 mRNA、BMP-2水平顯著降低，而B(niǎo)eclin-1 mRNA水平顯著升高[4]。為此，筆者對(duì)比分析了稽留流產(chǎn)患者及健康人工流產(chǎn)者的一般資料及子宮蛻膜組織中PSG1 mRNA、BMP-2、Beclin-1 mRNA水平，旨在探討稽留流產(chǎn)的相關(guān)因素，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年6月至2019年6月綿陽(yáng)市中心醫(yī)院收治的稽留流產(chǎn)患者50例作為觀察組，均符合第八版婦產(chǎn)科學(xué)稽留流產(chǎn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。另外，選取同期因意外懷孕于綿陽(yáng)市中心醫(yī)院行人工流產(chǎn)的健康女性50例作為對(duì)照組。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并神經(jīng)系統(tǒng)疾病者；有嚴(yán)重傳染性疾病者；長(zhǎng)期服用免疫抑制劑者；合并盆腔腫瘤者；有急性上呼吸道感染者；物質(zhì)濫用者。本研究經(jīng)該院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬均知情并同意本研究。

1.2方法

1.2.1資料與數(shù)據(jù)的記錄和比較 觀察并記錄兩組患者一般資料[包括性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、卵泡刺激素(FSH)/黃體生成素(LH)、人工流產(chǎn)次數(shù)、自然流產(chǎn)次數(shù)、不孕時(shí)間)、PSG1 mRNA、BMP-2及Beclin-1 mRNA水平]。mRNA水平以相對(duì)表達(dá)量表示，BMP-2水平以表達(dá)分?jǐn)?shù)表示，比較兩組間PSG1 mRNA、BMP-2及Beclin-1 mRNA水平差異。

1.2.2mRNA的檢測(cè) 兩組患者均進(jìn)行人工流產(chǎn)術(shù)，術(shù)中取子宮蛻膜組織，經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗血跡后，于-80 ℃冰箱中保存待檢。取子宮蛻膜組織20 mg，采用Magzol試劑結(jié)合過(guò)柱法提取總RNA，檢測(cè)總RNA純度、濃度及完整性，用Thermo Scientific RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒，以2 μg RNA作為模版進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。然后以cDNA為模板，以無(wú)RNA酶的DEPC水作陰性對(duì)照，待測(cè)樣品及陰性對(duì)照均設(shè)3個(gè)復(fù)孔進(jìn)行檢測(cè)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)蛻膜組織中PSG1 mRNA、Beclin-1 mRNA水平。qPCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。PSG1上游引物序列為5′-TGCACACAGCGCATCAAA-3′，下游引物序列為5′-CTCCTCTAGTCCCATCATCTCC-3′；Beclin-1上游引物序列為5′-AACCAACGTCTTTAATGCAACCTTC-3′，下游引物序列為5′-AGCAGCATTAATCTCATTCCATTCC-3′；β-actin上游引物序列為5′-GCCGCCAGCTCACCAT-3′，下游引物序列為5′-AATCCTTCTGACCCATGCCC-3′。反應(yīng)體系為10 μL。應(yīng)用Bio-Rad qPCR儀進(jìn)行PSG1 mRNA、Beclin-1 mRNA的檢測(cè)。PSG1 mRNA qPCR檢測(cè)的反應(yīng)條件:95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，共40 個(gè)循環(huán)；Beclin-1 mRNA qPCR檢測(cè)的反應(yīng)條件:94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。記錄擴(kuò)增曲線和熔解曲線，根據(jù)擴(kuò)增曲線，得到每個(gè)樣本的循環(huán)閾值(Ct)值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算PSG1 mRNA、Beclin-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，重復(fù)3次檢測(cè)，取平均值。

1.2.3BMP-2的免疫組化檢測(cè) (1)取蛻膜經(jīng)生理鹽水漂洗后置于10%甲醛溶液中固定6～12 h后水洗10～20 min，經(jīng)梯度酒精脫水后浸蠟、石蠟包埋，5 μm切片;(2)pH 6.0枸櫞酸鹽緩沖液中加熱至95 ℃ 15 min修復(fù)抗原，冷卻后至3%H2O2溶液中浸泡20 min，平衡鹽緩沖液(TBS)洗2次;(3)加一抗37 ℃孵育30 min后置于4 ℃冰箱過(guò)夜，TBS緩沖液洗2次;(4)加HRP二抗37 ℃孵育20 min，TBS緩沖液洗2次;(5)DAB顯色15 min，自來(lái)水沖洗、蘇木素復(fù)染、沖洗;(6)脫水干燥、透明、封片。BMP-2抗體均為兔多克隆抗體(試劑購(gòu)自博奧森生物有限公司)。BMP-2表達(dá)分?jǐn)?shù)判定標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)用計(jì)算機(jī)輔助顯微圖像分析系統(tǒng)，每次隨機(jī)抽取5個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行觀察；以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，無(wú)著色為陰性細(xì)胞；細(xì)胞染色強(qiáng)度從棕黃色、橘黃色、淡黃色染色至無(wú)著色依次減弱，分別計(jì)3、2、1、0分，同時(shí)按陽(yáng)性細(xì)胞百分率計(jì)分:>75%計(jì)4分，>50%～75%計(jì)3分，>25%～50%計(jì)2分，5%～25%計(jì)1分，<5%計(jì)0分，染色分?jǐn)?shù)和陽(yáng)性細(xì)胞百分率計(jì)分相乘得到表達(dá)分?jǐn)?shù)。

2 結(jié) 果

2.1兩組間PSG1 mRNA、BMP-2、Beclin-1 mRNA水平比較 觀察組PSG1 mRNA、BMP-2水平低于對(duì)照組(P<0.05)，Beclin-1 mRNA水平高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組間PSG1 mRNA、BMP-2、Beclin-1 mRNA水平的比較

2.2稽留流產(chǎn)單因素分析 年齡、BMI、FSH/LH、人工流產(chǎn)次數(shù)、自然流產(chǎn)次數(shù)、不孕時(shí)間、PSG1 mRNA、BMP-2、Beclin-1 mRNA水平與稽留流產(chǎn)具有相關(guān)性(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 稽留流產(chǎn)的單因素分析[n(%),n=50]

2.3稽留流產(chǎn)的多因素Logistic回歸分析 經(jīng)Logistic回歸分析，人工流產(chǎn)次數(shù)、自然流產(chǎn)次數(shù)、不孕時(shí)間、PSG1 mRNA、BMP-2、Beclin-1 mRNA水平與稽留流產(chǎn)具有相關(guān)性(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 稽留流產(chǎn)的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

稽留流產(chǎn)不僅危害母體健康，而且死胎長(zhǎng)期留在體內(nèi)可能會(huì)影響下次妊娠及胚胎著床。為此，及時(shí)識(shí)別稽留流產(chǎn)并采取相應(yīng)干預(yù)措施在稽留流產(chǎn)的防治中顯得尤為重要[6]。稽留流產(chǎn)的發(fā)生過(guò)程：早期妊娠囊胚著床后，絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞侵入母體螺旋動(dòng)脈，形成“滋養(yǎng)細(xì)胞栓”，閉合了螺旋動(dòng)脈，限制母血流入，導(dǎo)致胎盤(pán)在低氧狀態(tài)中發(fā)育，最終導(dǎo)致流產(chǎn)。由于低氧狀態(tài)會(huì)提高滋養(yǎng)細(xì)胞的應(yīng)激水平，介導(dǎo)細(xì)胞自噬的產(chǎn)生，子宮蛻膜組織中的胚胎相關(guān)因子水平也會(huì)受到顯著影響。

PSG1是孕期母體中發(fā)現(xiàn)的主要胎盤(pán)蛋白，胎盤(pán)合胞體滋養(yǎng)層是PSG1的主要來(lái)源。PSG1具有一定的免疫功能，能通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)胚胎的免疫功能。有研究發(fā)現(xiàn)，在胎兒缺血、缺氧等應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，PSG1的水平有明顯波動(dòng)[7]。在保護(hù)胎兒的同時(shí)，PSG1對(duì)母體也有一定的免疫增強(qiáng)功能。骨形成蛋白(BMP)是一組具有類(lèi)似結(jié)構(gòu)的高度保守的功能蛋白，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β家族。BMP-2能刺激DNA的合成和復(fù)制，從而促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞定向分化為成骨細(xì)胞。它還是體內(nèi)誘導(dǎo)骨和軟骨形成的主要因子，并在肢體生長(zhǎng)、軟骨內(nèi)骨化、骨折早期、軟骨修復(fù)時(shí)表達(dá)，對(duì)骨骼的胚胎發(fā)育和再生修復(fù)起重要作用。在胚胎發(fā)育的早期，BMP-2表達(dá)水平較為穩(wěn)定，當(dāng)出現(xiàn)胎兒宮內(nèi)窘迫時(shí)BMP-2水平受到顯著影響，呈下降趨勢(shì)[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，稽留流產(chǎn)患者胎盤(pán)細(xì)胞自噬功能顯著增強(qiáng)，可能與胎盤(pán)細(xì)胞的自我保護(hù)有關(guān)，而其中自噬相關(guān)蛋白Beclin-1在這個(gè)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[9-10]。

本研究中，觀察組患者PSG1 mRNA、BMP-2水平均低于對(duì)照組，觀察組Beclin-1 mRNA水平高于對(duì)照組，可能與稽留流產(chǎn)患者胎盤(pán)系統(tǒng)應(yīng)激反應(yīng)及自噬的激活有關(guān)[10-11]。單因素分析和多因素Logistic回歸分析顯示，人工流產(chǎn)次數(shù)、自然流產(chǎn)次數(shù)、不孕時(shí)間、PSG1 mRNA、BMP-2、Beclin-1 mRNA水平與稽留流產(chǎn)具有一定的相關(guān)性。有研究發(fā)現(xiàn)，首次流產(chǎn)患者子宮蛻膜組織PSG1 mRNA、BMP-2、Beclin-1 mRNA水平與再次妊娠時(shí)子宮蛻膜組織上述指標(biāo)的水平具有一定的相關(guān)性[12-14]，這意味著若首次妊娠時(shí)上述指標(biāo)的水平異常則下次妊娠時(shí)這些指標(biāo)水平異常風(fēng)險(xiǎn)會(huì)增加，這對(duì)于想再次妊娠的患者具有一定的意義。

綜上所述，人工流產(chǎn)次數(shù)、自然流產(chǎn)次數(shù)、不孕時(shí)間、PSG1 mRNA、BMP-2、Beclin-1 mRNA水平與稽留流產(chǎn)具有一定的相關(guān)性，可為稽留流產(chǎn)的診斷提供參考。