武漢市流感病毒流行特征及檢測方法的比較

盛鄂湘，陳良君，段勇威，李一榮

武漢大學中南醫院檢驗科，湖北武漢 430061

流感病毒是引起急性呼吸道感染的主要病原體之一，具有傳播途徑廣，傳染性強，極易引起局部流行和暴發大流行等特點。流感病毒屬于正黏病毒科,為單股、負鏈、分節段的RNA病毒。根據核蛋白和基質蛋白的不同，流感病毒可以分為甲、乙、丙、丁4個型別[1]。人感染流感病毒嚴重者可導致病毒性肺炎、多臟器功能損傷、呼吸衰竭甚至死亡。流感的流行具有明顯的季節性，中國的流感疫情暴發主要集中在秋冬季節，南方地區是流感樣病例的高發地區[2]。

目前人類無法有效地防控流感的流行，也缺乏可靠的預警、預測手段。每一次流感的大流行，都會對人類健康構成嚴重威脅和給社會造成巨大的經濟損失[3]。因此，應進一步加大流感監測力度，密切關注流感病毒的變異及活動狀態[4]。目前，流感患者的臨床癥狀缺乏特異性，一般以輕癥感染為主，但也可為重癥并導致患者住院甚至死亡[5]，臨床醫生僅憑臨床表現難以確診，所以實驗室病原學檢測成為流感的主要診斷依據。流感病毒的檢測方法有病毒的分離培養、血清學檢測和病毒的快速檢測，應用了免疫學和基因檢測技術。病毒的分離培養是流感診斷的金標準，常依賴于雞胚接種，是流感實驗室診斷中高度靈敏、準確的方法之一，但雞胚接種分離周期長，分離效率低[6]。血清學方法是檢測流感病毒特異性抗體最常用的方法，如血凝抑制試驗(HAI),但靈敏度難以令人滿意[7]。膠體金法快速檢測是利用抗原抗體反應，然后用膠體金結合物標記達到檢測的目的；其優點是快速、簡便，大大縮短了檢測時間；靈敏、準確，結果受外界因素影響較少；安全簡便，不需任何儀器和設備；成本低廉，所需時間和樣本量少[8]；但不能檢測病毒亞型。臨床上大多用此方法來初步快速篩查流感患者。PCR技術可以從核酸水平檢測病毒，具有高靈敏度、特異度和較高的檢出率，檢測標本用量少，在病毒感染診斷中發揮著重要作用。

本研究對武漢市甲型流感(以下簡稱“甲流”)、乙型流感(以下簡稱“乙流”)的流行病學特征進行了分析；選取600份經流感病毒膠體金法檢測的標本，然后用巢式PCR來進行結果復核，旨在評價膠體金法檢測的靈敏度和特異度能否滿足流感患者初篩或診斷的要求。

1 資料與方法

1.1一般資料 根據《全國流感監測方案(2010年版)》中流感樣病例的定義：發熱(體溫≥38 ℃)，伴咳嗽或咽痛者，將2017—2019年因流感樣癥狀于本院就診的患者共60 944例納入研究，采集患者的鼻咽拭子標本，在檢驗科門診進行流感病毒膠體金法檢測；選取其中的600份樣本，采用巢式PCR檢測對結果進行復核。

1.2方法

1.2.1咽拭子標本的采集和保存 將拭子從口腔完全插入咽喉中，以咽喉壁，上顎扁桃的發紅部位為中心，適度用力擦拭雙側咽扁桃體及咽后壁，避免觸及舌部。采集完拭子后，迅速將其放入采樣管(內含3～4 mL標本保存液)中，棄去尾部，旋緊管蓋并密封，保存至-70 ℃冰箱。

1.2.2流感病毒膠體金法檢測 應用廣州萬孚生物技術股份有限公司生產的甲/乙型流感病毒抗原檢測試劑盒(膠體金法)對甲/乙型流感病毒抗原進行檢測，嚴格按照試劑盒檢測說明書進行操作并在有效期內使用。

1.2.3流感病毒的巢式PCR檢測 采用美國TRIzol即用型試劑提取咽拭子標本的核酸，按照實驗室標準操作流程進行。以武漢大學基礎醫學院病毒研究所實驗室提供的特異性引物和擴增條件進行第一輪擴增：引物序列，上游為GAYCCNCCNTACAGCCATGG，下游為AYCCTCTNATTTGCATYCCNGG；擴增條件如下，50 ℃ 30 min，94℃ 3 min，94℃ 45s、52 ℃ 45s、72℃ 50 s(36個循環)，72℃ 10 min。第二輪擴增：引物序列，上游為ACNGGNTAYACNATGGACACRGT，下游為PB1_679R CCTCTYTCNGCRTCYTTNGTCAT；擴增條件如下，94 ℃ 3 min，94 ℃ 45 s、52 ℃ 40 s、72 ℃ 45 s(36個循環)，72 ℃ 10 min。制備1%瓊脂糖凝膠，取5 μL第二輪擴增產物，在120 U的電壓下，電泳20 min，在526 bp對應區段出現陽性條帶者為檢測陽性。

1.3統計學處理 采用SPSS22.0軟件進行統計分析。計數資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。采用Kappa一致性檢驗分析兩種方法的一致性：若Kappa為0.0～<0.20，則一致性極低；若Kappa為0.20～0.40，則一致性一般；若Kappa為>0.40～0.60，則一致性中等；若Kappa為>0.60～0.80，則一致性高；若Kappa為>0.80～1.00，則幾乎完全一致。

2 結 果

2.12017—2019年流感病毒檢測的總體情況 2017—2019年，各年份中甲流、乙流、混合感染檢出率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 武漢市2017—2019年流感病毒的流行情況[n(%)]

2.2流感病毒檢出例數在不同月份的分布特點 2017年的檢出高峰為8月、9月和12月；2018年的檢出高峰為12月、1月和2月；2019年與2017和2018年比較，檢測總例數增加，從而各月份的檢出例數有所增加，且檢出高峰集中在1月、2月和12月；見圖2。

圖2 2017—2019年流感病毒檢出例數在不同月份的分布情況

2.3不同年齡患者的流感病毒感染情況 6歲以下及6～18歲的人群的流感病毒檢出率較高，分別為24.53%和27.26%，各年齡段之間比較，差異有統計學意義(χ2=1 490.85，P<0.05),見表2。

表2 2017—2019年不同年齡段患者的流感病毒檢出率

2.4流感病毒膠體金法和巢式PCR檢測結果的比較 選取2018年1月份采集的600份流感樣病例的標本，采用巢式PCR檢測進行復核。兩種方法一致性檢驗的Kappa系數為0.40，一致性一般。見表3。

表3 膠體金法與巢式PCR檢測的結果

3 討 論

流行性感冒是由于流感病毒感染人或動物，導致其急性發病的一類以上呼吸道癥狀為特點的疾病。參與流感病毒復制的RNA聚合酶沒有校正功能，所以流感病毒會頻繁地出現基因突變。流感病毒具有節段分布的結構特點，易導致基因重組，亦稱抗原漂移[9]，這種變異易發生于甲型流感病毒，導致產生新的病毒亞型，人類歷史上多次流感流行或暴發均與其相關[10]。乙型流感病毒只有一種型別，病毒變異少，其感染者為散發病例。本研究中，甲流檢出率高于乙流，混合感染的檢出率最低。流感病毒的流行具有明顯的季節性，北方流行均發生在冬春季，而南方大部分發生在秋冬季或夏季[11]。本研究中，流感也具有季節流行性。

流感病毒的易感人群為老年人、兒童、慢性病人群，以及免疫功能受到抑制者[12]。本研究對不同年齡段人群的病毒感染情況的分析表明，陽性患者中18歲以下的人群所占比例最高，特別是6歲以下的嬰幼兒，為流感病毒的主要傳播對象；而45歲以上的中年和老年人所占比例較低。這可能與就診習慣有關，嬰幼兒和青少年以發熱和上呼吸道感染癥狀作為初始就診原因的比例較高，較易篩查出流感病例，而中年人和老年人則以其他主訴癥狀為就診原因的居多。對兒童和有基礎疾病的老年人均應加強防護措施，及時接種疫苗，預防流感。

流感病毒感染者的癥狀不明顯，臨床診斷主要依賴于實驗室檢測，可引起人類呼吸道感染的病毒有200余種，因此檢測試劑和方法的靈敏度和特異度對臨床診斷尤為重要。巢式PCR的檢測具有高特異度，和定量PCR相比，靈敏度提高了，可以減少假陰性結果的出現，有助于臨床治療[13]。而流感病毒快速檢測試劑具有操作簡單、快捷，分析結果清楚、易于判斷，且不需要任何儀器、成本低廉等優點，非常適用于臨床大量標本的初篩[14]。本研究中，膠體金法和巢氏PCR檢測結果的一致性一般，具有較高的靈敏度和特異度。假陰性出現的原因可能為膠體金法檢測依賴于抗原的表達，病毒感染初期和后期受自身免疫系統清除的影響，抗原的表達量低，未達到試劑盒的檢測限。當臨床流感癥狀明顯而膠體金法檢測陰性時，應進一步檢測。出現假陽性的原因可能是包被的病毒抗體純化不夠，導致其和非特異性病毒發生交叉反應。本課題組后續還將膠體金法檢測結果為假陰性的118例樣本送去測序，發現其中80.95%為甲型H1N1，1.20%為甲型H3N2,14.29%為甲型H5N6，3.60%為乙型流感，表明漏檢的樣本主要是甲流H1N1,為臨床醫生提供了一定的判斷依據，同時本研究中發現巢氏PCR檢測存在一定的污染，應注重實驗人員的操作技能和專業培訓。

流感的發生具有明顯的季節性，發病率具有上升的趨勢，好發于秋冬季，應加強流感病毒變異的監測和防控。6歲以下的嬰幼兒是流感的高發和易感人群，應及時接種疫苗，加強管理。膠體金法檢測操作快速、簡便，能基本滿足對臨床大量標本進行初篩和診斷的要求，但還應不斷提高靈敏度和特異度，為流感病毒的早期、準確篩查提供更有效的幫助。