化痰祛瘀法調控miRNA影響巨噬細胞抗動脈粥樣硬化的分子機制研究

張永晨，秦合偉，趙平麗，周子朋

(1.駐馬店市中醫院，河南 駐馬店 463000；2.河南中醫藥大學第二附屬醫院，河南 鄭州 450002)

動脈粥樣硬化(athcrosclerosis，AS)是冠心病、腦梗死和腦供血不足等缺血性心腦血管疾病的病理基礎，脂質代謝紊亂和炎性反應是導致AS形成的主要原因[1]。研究發現小分子RNA-microRNA-467b可能參與了脂質代謝與炎癥因子的調控[2-3]。有研究者發現miR-467b能夠靶向調控脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase, LPL)，促進泡沫細胞形成、降低炎癥因子表達水平及調控黏附分子水平，影響脂質沉積和黏附因子表達，引起AS的發生[4]。既往研究發現，化痰祛瘀法能夠通過調節血脂、抗炎、保護血管內皮、抑制血小板聚集和調節免疫等作用，發揮抗AS的作用[5-6]，但化痰祛瘀法調節血脂、抗炎的具體分子機制還不明確。本實驗通過觀察化痰祛瘀法含藥血清對miRNA-467b的調控，影響炎性因子分泌和巨噬細胞脂質蓄積，揭示化痰祛瘀法調節血脂、抗炎的具體分子機制，研究中醫藥抗動脈粥樣硬化的內在分子機制。

1 材料

RAW264.7巨噬細胞株購自中國科學院上海生命科學研究所。化痰祛瘀法所用方劑血管軟化丸藥物組成包括：山楂30 g，神曲30 g，萊菔子15 g，陳皮12 g，清半夏9 g，茯苓15 g，連翹12 g，郁金12 g，枸杞子15 g，三七12 g，丹參12 g，珍珠30 g，代赭石30 g。中藥飲片均來源于河南省中醫院藥劑科，根據要求濃縮成不同濃度的溶液(血管軟化丸高劑量：濃度為3.456 g/mL；血管軟化丸低劑量：濃度為0.864 g/mL)[5]。本研究所涉及的相關材料均通過本單位倫理委員會審查和批準。

2 方法

2.1 實驗血清的制備

將30只雄性健康SD大鼠隨機分為3組，每組10只，即高劑量組、低劑量組和對照組，分別給予血管軟化丸86.4 g/(kg·d)、21.6 g/(kg·d)和等量的生理鹽水灌胃，每日早晚2次，連續5 d，末次灌胃后1 h，麻醉取血，分離血清，0.45 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝，-20 ℃保存備用[5]。

2.2 細胞培養及分組

將RAW264.7巨噬細胞株細胞密度達到80%，棄去培養基，HBSS洗滌，去除培養基；0.25%胰酶消化5～10 min；彎嘴吸管稍用力均勻吹打下來，經過傳代，取第3～5代巨噬細胞進行實驗。

1)對照組：巨噬細胞+DMEM培養基；2)模型組：巨噬細胞+ox-LDL造模；3)miR-467b mimic組：巨噬細胞+ox-LDL造模后參照脂質體2000說明書轉染微小RNA-467b mimic轉染進入RAW264.7細胞；4)高劑量組：巨噬細胞+ ox-LDL+中藥高劑量含藥血清；5)低劑量組：巨噬細胞+ ox-LDL+中藥低劑量含藥血清。

2.3 建立巨噬細胞損傷模型

2.3.1 巨噬細胞活性檢測

將巨噬細胞混懸液 (1×105cells/mL)，接種于6孔板中(30 000個細胞/孔)，37 ℃ 5% CO2培養箱培養，分別用不同濃度的ox-LDL (5、10、20、40、80 mg/L)培養液200 μL/孔，實驗組為巨噬細胞加入濃度為5 mg/L的ox-LDL，同時設立正常對照組及空白對照組，正常對照組為巨噬細胞加正常細胞培養基，空白對照組只加培養基，不加細胞。采用酶標儀490 nm測定吸光度 (absorbance,A)值，并按照下列公式進行計算[7]。

細胞的存活率(%)=(實驗組A值-空白對照組A值)/(正常對照組A值-空白對照組A值)×100%

2.3.2 巨噬細胞膜通透性檢測

選取實驗組(ox-LDL組)和正常組細胞，將巨噬細胞(1×105cells/mL)接種于6孔細胞培養板中，根據存活率實驗結果，選擇合適濃度的ox-LDL培養液2 mL/孔，細胞培養結束后用0.2%胰酶消化收集細胞，按試劑盒說明書對細胞進行染色，采用流式細胞儀檢測實驗組和正常組細胞的增殖和凋亡[7]。

2.4 血清干預巨噬細胞

細胞凋亡和增殖的檢測：不同組別給予不同含藥血清干預，按Hoechst33258試劑盒說明書染色，熒光顯微鏡下觀察細胞形態并拍照，并用流式細胞儀檢測細胞凋亡和增殖[7]。

2.5 巨噬細胞轉染實驗

在無菌條件下，用含有10% FBS的細胞培養基DMEM，將巨噬細胞(1×105cells/mL)接種于6孔板，每孔含有2 mL培養基，培養箱孵育備用；取miR-467b mimic 0.6 μL和HiPerFect轉染試劑12 μL滴加入300 μL的不含FBS和抗生素的DMEM細胞培養基，混合均勻，使其終濃度為5 nmol/L；在室溫條件下(15～25 ℃)，放置5～10 min，直至形成轉染復合物；更換含ox-LDL(5 mg/L)的低糖DMEM細胞培養基培養孵育，等到巨噬細胞的融合度約達到80%時，終止培養，刮取細胞，以提取巨噬細胞的RNA和總蛋白[7]。

2.6 RT-PCR法檢測RAW264.7巨噬細胞中pri-miR-467b mRNA、LPL mRNA表達

收集干預后和轉染后的巨噬細胞，分離提取總RNA，進行RT-PCR反應，反應條件：94 ℃預變性；94 ℃ 50 s，55 ℃ 55 s，72 ℃ 60 s，72 ℃ 10 min共 30個循環[8]，根據PCR反應信號強度Ct值計算每個樣本目的基因mRNA的相對表達量，引物序列見表1。

表1 pri-miR-467b、LPL的引物序列

2.7 Western blotting檢測巨噬細胞中LPL蛋白表達

收集巨噬細胞，PBS洗滌3次，用試劑盒提取蛋白后，按步驟進行試驗，使用Image J的軟件分析條帶灰度值，測定目的條帶和內參照β-actin的灰度值，結果以樣本灰度值/內參照灰度值表示[8]。

2.8 高效液相色譜(HPLC)法檢測巨噬細胞內的膽固醇水平

用15 %KOH的醇溶液除去小鼠單核巨噬細胞樣品中的甘油三酯，用6 %三氯乙酸除去其中蛋白質，然后以體積比為3∶2的正己烷與異丙醇混合溶劑提取巨噬細胞內的膽固醇，檢測細胞內總膽固醇(total cholesterol, TC)、游離膽固醇(free cholesterol, FC)和膽固醇酯(cholesterol ester, CE)的含量[9]。

2.9 ELISA法檢測培養基中炎癥因子水平

取干預后細胞上清液，用酶聯免疫吸附實驗(ELISA法)測定細胞白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)、α-干擾素(TNF-α)和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)水平，試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，嚴格按照試劑盒說明書操作。

2.10 統計學方法

3 結果

3.1 ox-LDL對巨噬細胞增殖和凋亡影響

選取5 mg/L濃度的ox-LDL干預巨噬細胞后，實驗組巨噬細胞存活率為71.37%，正常組巨噬細胞存活率98.56%，差異具有統計學意義(P<0.05)。實驗組巨噬細胞增殖率低于正常組(P<0.05)，實驗組巨噬細胞凋亡率高于正常組(P<0.05)，表明造模成功。結果見表2。

表2 ox-LDL對巨噬細胞增殖和凋亡影響

3.2 血清干預和RNA-467b mimic轉染巨噬細胞后細胞凋亡觀察

干預和轉染后，采用流式細胞儀檢測，結果顯示，與對照組相比，其他各組的巨噬細胞凋亡率明顯高于對照組(P均<0.05)，而miR-467b mimic組和高劑量、低劑量組的巨噬細胞凋亡率均低于模型組(P均<0.05)，但高劑量組和低劑量組之間比較差異不明顯(P>0.05)。結果見表3。

3.3 血清干預和RNA-467b mimic轉染巨噬細胞后細胞增殖的形態觀察

干預和轉染后，采用流式細胞儀檢測，結果顯示，與對照組相比，其他各組的巨噬細胞增殖率明顯低于對照組(P均<0.05)，而miR-467b mimic組和高劑量、低劑量組的巨噬細胞增殖率均高于模型組(P均<0.05)，但高劑量組和低劑量組之間比較差異不明顯(P>0.05)。結果見表3。

表3 血清干預巨噬細胞后細胞增殖和凋亡檢測結果

3.4 含藥血清和RNA-467b mimic轉染對巨噬細胞pri-miR-467b和LPL mRNA表達的影響

干預和轉染后，RT-PCR法檢測結果顯示，與對照組相比，其他各組巨噬細胞pri-miR-467b mRNA表達明顯低于對照組(P<0.05)，而miR-467b mimic組和高劑量、低劑量組巨噬細胞pri-miR-467b mRNA表達明顯高于模型組(P<0.05)，但高劑量組和低劑量組之間pri-miR-467b mRNA比較差異不明顯(P>0.05)。與對照組相比，其他各組巨噬細胞中LPL mRNA 表達明顯高于對照組(P<0.05)，而miR-467b mimic組、高劑量組和低劑量組巨噬細胞中LPL mRNA表達明顯低于模型組(P<0.05)，兩組巨噬細胞中LPL mRNA比較差異不明顯(P>0.05)，結果見表4。

表4 含藥血清和轉染干預對巨噬細胞pri-miR-467b和LPL mRNA和蛋白表達的影響相對表達量,n=6)

3.5 含藥血清和RNA-467b mimic轉染對巨噬細胞LPL蛋白表達的影響

干預和轉染后，Western blotting法檢測結果顯示，與對照組相比，其他各組巨噬細胞中LPL蛋白表達明顯高于對照組(P<0.05)，而miR-467b mimic組、高劑量組和低劑量組巨噬細胞中LPL蛋白表達明顯低于模型組(P<0.05)，但高劑量組和低劑量組之間巨噬細胞中LPL蛋白比較差異不明顯(P>0.05)，結果見圖1，表4。

圖1 含藥血清和RNA-467b mimic轉染對巨噬細胞LPL蛋白表達的影響

3.6 HPLC法檢測巨噬細胞內的膽固醇水平

干預和轉染后，HPLC法檢測細胞內TC、FC和CE的含量，結果顯示，與對照組相比，其他各組巨噬細胞內的TC、CE水平明顯高于對照組(P<0.05)，而miR-467b mimic組、高劑量組和低劑量組巨噬細胞內的TC、CE水平明顯低于模型組(P<0.05)，但高劑量組和低劑量組之間比較差異不明顯(P>0.05)。與對照組相比，其他各組巨噬細胞內的FC水平明顯低于對照組(P<0.05)，而miR-467b mimic組、高劑量組和低劑量組巨噬細胞內的FC水平明顯高于模型組(P<0.05)，但高劑量組和低劑量組之間比較差異不明顯(P>0.05)。結果見表5。

表5 含藥血清和RNA-467b mimic轉染對巨噬細胞內的膽固醇水平的影響

3.7 含藥血清和RNA-467b mimic轉染對巨噬細胞培養基中炎癥因子的影響

干預和轉染后，ELISA法檢測結果顯示，與對照組相比，其他各組巨噬細胞培養基中IL-6、IL-1β、TNF-α和 MCP-1水平明顯高于對照組(P<0.05)，而miR-467b mimic組、高劑量組和低劑量組巨噬細胞培養基中IL-6、IL-1β、TNF-α和 MCP-1水平明顯低于模型組(P<0.05)，高劑量組和低劑量組巨噬細胞中IL-6、IL-1β、TNF-α和 MCP-1水平比較差異不明顯(P>0.05)。結果見表6。

表6 含藥血清和轉染干預對巨噬細胞培養基中炎癥因子的影響

4 討論

動脈粥樣硬化的發病機制主要有脂質浸潤學說和炎癥損傷反應學說。脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase, LPL)是水解血漿乳糜微粒和VLDL中甘油三酯的限速酶，LPL作為脂蛋白代謝的鍵酶，能夠降低血漿甘油三酯水平并增加HDL-C水平，加速肝臟對脂蛋白的清除[10]。血漿中VLDL、LDL和脂蛋白殘粒侵入血管壁沉積聚集，導致血管內膜的增厚和管腔的狹窄，另一方面，在多種因素的刺激下，泡沫化的巨噬細胞，導致大量炎癥因子分泌，促進炎癥細胞大量黏附、浸潤和基質降解引起 AS斑塊破裂[11]。脂質蓄積與炎癥因子表達密切相關，兩者相互促進、相互影響、協同作用，研究者采用siRNA干擾巨噬細胞中的LPL后，IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1等炎癥因子分泌水平明顯下調，該研究提示巨噬細胞中的LPL具有促進炎癥因子分泌的作用[12]。

研究者還發現，當用ox-LDL處理巨噬細胞后，LPL與蛋白聚糖結合并以分子橋的作用促進ox-LDL大量進入細胞內，使得細胞內的膽固醇大量蓄積，IL-6、IL-1β、TNF-α 和MCP-1分泌大量增加，而RAW264.7巨噬細胞中轉染miR-467b類似物或抑制劑后，發現miR-467b顯著降低了脂質沉積和IL-6，IL-1β，TNF-α和MCP-1等炎癥因子的分泌，進而起到防止巨噬細胞泡沫化的作用，這可能與miR-467b靶向調控LPL有關[12-13]。

基于前期大量的臨床和實驗研究，課題組認為動脈粥樣硬化的病因病機與“痰濁”“血瘀”密切相關，痰瘀證候是AS的主要證型[14-15]，提出了化痰祛瘀的治療大法。化痰祛瘀的具體方劑血管軟化丸即依此組方，血管軟化丸方中山楂消一切飲食積滯，為君藥；神曲長于化酒食陳腐之積,萊菔子長于消谷物面食之積,半夏、茯苓健脾燥濕化痰,郁金、丹參、三七行氣散結、活血化瘀,枸杞子滋補肝腎,珍珠母、代赭石平肝潛陽、降逆祛痰共為臣藥；陳皮理氣和中為佐藥；甘草調和諸藥為使。諸藥合用，共奏消積化痰、活血化瘀之功，使痰瘀同治，血行痰清，氣血流通[8]。既往臨床研究發現，血管軟化丸能夠調節血脂代謝，調節血清炎性因子水平，改善血管內皮損傷，防治AS，此外血管軟化丸還能夠抑制頸動脈斑塊形成，防治腦梗死[16-17]。動物實驗研究發現，血管軟化丸能夠調控TLR9介導巨噬細胞極化效應，通過調控miR-33a影響ABCA1表達，抑制動脈粥樣硬化的發生發展[18-19]。新近研究發現，血管軟化丸能夠調控CD40-CD40L系統調控血小板活化抑制動脈粥樣硬化[6]，但血管軟化丸調節血脂、抗炎的具體分子機制還不明確。

研究結果顯示，化痰祛瘀法代表方劑血管軟化丸的含藥血清能夠降低ox-LDL損傷模型的RAW264.7巨噬細胞凋亡率，提高巨噬細胞增殖率，能提高巨噬細胞中pri-miR-467b mRNA表達水平，降低巨噬細胞中LPL mRNA和蛋白表達水平，降低巨噬細胞內的TC、CE水平，降低巨噬細胞培養基中IL-6、IL-1β、TNF-α和 MCP-1水平；且高劑量組和低劑量組間比較差異不明顯。本研究結果表明化痰祛瘀中藥復方血管軟化丸調節血脂、抗炎作用，抑制AS的分子機制可能與調控miRNA-467b，進而靶向LPL調控巨噬細胞脂質蓄積，減少 IL-6、IL-1β、TNF-α和 MCP-1 等炎性因子分泌有關，且不存在量效差異；本研究能夠為AS和脂質代謝紊亂性疾病的防治提供實驗依據，為中醫臨床客觀診療AS提供科學依據和理論基礎。