柴胡龍骨牡蠣湯對精神分裂模型大鼠行為學及免疫系統的影響

孟祥杰，李自輝，龐牧，林佩锜，劉樹民*

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.馬來西亞惠民中醫藥針灸治療中心，吉隆坡 661000)

精神分裂癥是一種嚴重的精神疾病，其病因尚不明晰。目前多采用西藥治療，但有一定不良反應，尋找一種理想藥物對其進行治療是當前的熱點。中醫學認為精神分裂癥屬于“癲狂病”的范疇，臨床多表現為感知、思維、情緒、行為等障礙和精神不協調。柴胡龍骨牡蠣湯，原方載于《傷寒論》，在臨床中多用于治療精神神經疾病。龐偉[1]研究發現,柴胡龍骨牡蠣湯聯合利培酮能提高精神分裂癥患的治療效果。周東豐等[2]研究發現,免疫異常可能在精神分裂癥的發病機制中起關鍵作用，其存在免疫功能的紊亂，包括以細胞因子介導的免疫功能異常和體液免疫的改變，抗精神藥物對細胞因子及抗氧化能力也有影響。本研究通過對精神分裂癥大鼠行為學分析以及免疫和抗氧化能力進行測試，探討柴胡龍骨牡蠣湯對精神分裂病癥的相關影響。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

健康雄性SPF級SD大鼠60只，體質量(220±20)g，購自遼寧長生生物技術有限公司,許可證號：SCXK(遼)2015-0001。飼養于黑龍江中醫藥大學實驗動物中心屏障系統內，室溫(22±1)℃，濕度45%，適應性喂養7 d后進行實驗。

1.2 藥物與試劑

柴胡龍骨牡蠣湯藥材飲片購自黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，藥物組成中去鉛丹。組方：柴胡12 g，龍骨4.5 g，牡蠣4.5 g，黃芩4.5 g，生姜4.5 g，人參4.5 g，桂枝4.5 g，茯苓4.5 g，半夏6 g，大棗6枚和大黃6 g。將上述藥材于6倍量水中浸泡30 min，恒溫加熱進行提取，過濾，再加8倍量水提取，2次均冷凝回流1.5 h，合并藥液，過濾，減壓濃縮加工，得到水煎液，再經低溫干燥機中凍干，得到凍干粉末，提取后計算其出膏率約為14.8%。

地卓西平馬來酸鹽(MK-801，美國Sigma公司，批號：M107-50MG)；利培酮片(西安楊森制藥有限公司，批號：H20010309)；大鼠飼料(北京科澳協力有限公司，批號：2017041021)；注射用生理鹽水(哈爾濱三聯藥業有限公司)；SOD、MDA、IL-2、IL-6、IFN-γ、IgG、IgM、TNF-α、NO試劑盒(南京建成生物工程研究所)；PKC ELISA KIT試劑盒(Cusahio Biotech，LTD批號：A21038680)。

1.3 儀器

AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；YP10001電子稱(上海佑科儀器有限公司)；超低溫冰箱(賽默飛世爾科技中國有限公司)；KDC-160HR臺式高速冷凍離心機(科大創新股份有限公司中佳分公司)；Anthos2010酶標儀(奧地利安圖斯公司)；MT-200 Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(泰盟公司)；曠場實驗設備(北京金盛恒星醫療器械公司)。

2 方法

2.1 大鼠模型的制備

SD大鼠腹腔注射0.1 mg/kg的MK-801，每天1次，并于每日上午9時至10時完成造模工作，持續14 d。14 d后進行一般行為學評價，如果大鼠評價合格，則認定造模成功。

2.2 動物分組與給藥

造模前，從SD雄性大鼠中隨機選取10只作為正常組，對其余大鼠進行造模處理，將造模成功的大鼠隨機分為模型組和柴胡龍骨牡蠣湯高、中、低劑量組及利培酮組。柴胡龍骨牡蠣湯高、中、低劑量組按人體臨床上限劑量的4、2、1倍進行折算后給予柴胡龍骨牡蠣湯(即生藥材11.2、5.6、2.8 g/kg)，利培酮組給予利培酮0.4 mg/kg；正常組和模型組給予蒸餾水10 mL/kg，持續14 d，每日稱量大鼠體質量。

2.3 觀察內容

2.3.1 一般特征觀察

造模開始后，對各組大鼠進行詳細觀察，如大鼠的毛發、呼吸、運動以及大小便等，持續觀察記錄14 d。大鼠的一般行為學標準為:大鼠的活動是否正常、呼吸是否均勻，皮毛是否光亮，大小便是否正常。

2.3.2 刻板行為和共濟失調

對大鼠的刻板行為和共濟失調觀察并評分，共6次，每10 min 1次，共觀察60 min。對每只大鼠進行獨立觀察，并給予一個得分。根據盲法中的Sams Dodd和Hoff-man[3]標準，由2名實驗員對其進行獨立評定。每個行為測量的分數被確定為評級期間持續觀察到的最高級別的刻板行為或共濟失調，取其平均值。

刻板行為評分標準，0分：靜止不動，很少或沒有運動；1分：正常活動，偶爾向前運動；2分：伴隨重復向前探索的活動；3分：持續向前探索；4分：反復抬頭、搖頭或旋轉；5分：頭部快速晃動、旋轉或腹部背腹運動。

共濟失調評分標準,0分：協調運動；1分：輕度搖晃，站立不倒；2分：中度不協調運動，偶爾會頻繁跌倒；3分：無力支撐身體，爬行運動；4分：身體躺向一邊或腹側，不活動。

2.3.3 曠場實驗

采用曠場實驗設備評定，跟蹤大鼠的活動，并自動計數。此試驗在安靜的房間內進行，將大鼠放入中心方格內，觀察大鼠在10 min內的跨格總量，評價大鼠自主活動。

2.3.4 Morris水迷宮實驗

在造模及給藥后最后一天進行Morris水迷宮實驗。首先將各組大鼠逐一放到水迷宮中，該水迷宮中沒有平臺，讓其自由泳3 min，以此來幫助大鼠熟悉環境，然后進行水迷宮實驗。逃避潛伏期設為60 s，每天從4個入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄它們發現隱藏在水下平臺的時間(逃避潛伏期)，如果在設定的60 s時間內未找到平臺，將其引至平臺上10 s。持續訓練5 min，每天3次。第4天為定位航行實驗。隨機選取入水點，并將大鼠放入水池中，對60 s內大鼠穿越原平臺位置的次數、穿越原平臺位置所在象限的次數以及停留原平臺位置所在象限的時間進行記錄。同時測量大鼠在原平臺位置所在象限的游泳距離以及大鼠在所有象限中游泳的總距離，計算前者占后者的比，并將60 s內大鼠的游泳軌跡畫出來。通過這一實驗，考察大鼠對原平臺的記憶。最后，根據水迷宮配套的攝像記錄和EthoVision XT 10.1分析軟件，對每次測得的數據進行統計和分析。

2.4 樣品的制備

末次給藥24 h后，用20%的烏拉坦將大鼠麻醉，腹主動脈取血，將其放置在常溫下并靜置40 min后，3 500 r/min離心10 min，取上清液，存放于-80 ℃超低溫冰箱中備用。對凍存樣本進行解凍處理，并根據酶聯免疫檢測法，嚴格按照試劑盒說明書上提供的方法操作，檢測指標中相關含量。

胸腺指數(%)=胸腺重量(mg)/大鼠體重(g)×100%

脾臟指數(%)=脾臟重量(mg)/大鼠體重(g)×100%

2.5 統計學分析

3 結果

3.1 大鼠一般特征表現

在造模數分鐘后對大鼠的一般行為學進行觀察，過程中大鼠沒有死亡。正常組大鼠活動正常、呼吸均勻、皮毛光亮、大小便正常。模型組大鼠頭部一直抖動，表現出四肢無力的現象，且不能正常爬行，喜歡咬尾巴，繞圈拖行，皮毛多呈豎立的狀態，排尿增多，大便正常。利培酮組、柴胡龍骨牡蠣湯各組與模型組的大鼠行為相似。隨著時間延長，模型組的大鼠依舊躁動不安、并且四肢舞動、飲食減少。利培酮組和柴胡龍骨牡蠣湯各組的大鼠則得到了不同程度地改善，四肢舞動情況好轉，飲食恢復正常。

3.2 大鼠刻板行為和共濟失調評分

結果顯示，相較于正常組，模型組大鼠刻板行為和共濟失調評分明顯升高(P<0.01)。而柴胡龍骨牡蠣湯高劑量組、以及利培酮組與模型組比較，顯著降低了大鼠刻板行為和共濟失調評分(P<0.01)，見表1、圖1。

表1 各組大鼠刻板行為、共濟失調評價比較分)

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05。圖1 大鼠刻板行為、共濟失調評價(n=10)

3.3 大鼠曠場實驗結果

結果顯示，與正常組相比，模型組大鼠曠場實驗跨格總量有了明顯的升高(P<0.05)。相較于模型組，柴胡龍骨牡蠣湯高劑量組與利培酮組均降低了大鼠曠場試驗跨格的總量(P<0.05)，見表2、圖2。

表2 大鼠曠場實驗跨格總量比較格)

圖2 大鼠曠場實驗跨格總量(n=10)

3.4 大鼠定位航行

結果顯示，隨著實驗次數的增加，各組大鼠平均逃避潛伏期減少。相較于正常組，治療前各組大鼠平均逃避潛伏期升高(P<0.05)；在治療后，與正常組比較，模型組大鼠的平均逃避潛伏期明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，柴胡龍骨牡蠣湯高劑量組與利培酮藥組大鼠平均逃避潛伏期出現明顯減少(P<0.05)，見表3、圖3。

表3 大鼠水迷宮定位航行平均逃避潛伏期比較

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05。圖3 大鼠水迷宮定位航行平均逃避潛伏期(n=10)

3.5 大鼠空間探索

結果顯示，經過訓練的正常大鼠對原水下平臺的位置一般均有所記憶。在搜索中，正常大鼠會在原平臺位置附近搜索很多次，形成較多的穿越原平臺位置的次數，停留原平臺位置所在象限時間也更長，水迷宮軌跡圖如圖4所示。與正常組相比，模型組大鼠空間探索實驗有明顯差異(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，柴胡龍骨牡蠣湯高劑量組與利培酮組大鼠空間探索實驗出現明顯差異(P<0.05或P<0.01)，見圖4、表4、圖5。

注：A：正常組；B：模型組；C：低劑量組；D：中劑量組；E：高劑量組；F：利培酮組。圖4 柴胡龍骨牡蠣湯對精神分裂大鼠水迷宮軌跡圖

3.6 對大鼠血清中IL-2、IL-6、IFN-γ含量的影響

從表5、圖6可以看出，相比較于正常組，模型組血清中IL-2、IFN-γ的含量明顯減少(P<0. 01)，IL-6的含量明顯增加(P<0. 01)；相比較于模型組，柴胡龍骨牡蠣湯高劑量組與利培酮組大鼠血清IL-2和IFN-γ的含量明顯升高(P<0.01)，IL-6的含量明顯降低(P<0. 01)；柴胡龍骨牡蠣湯中劑量組血清IL-6的含量下降(P<0. 05)，IFN-γ的含量上升(P<0. 05)，差異具有統計學意義。

注：與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲▲P<0.05，P<0.05。圖5 大鼠水迷宮大鼠空間探索實驗評價(n=10)

表4 大鼠水迷宮大鼠空間探索實驗評價情況比較

表5 大鼠血清中IL-2、IL-6、IFN-γ含量的影響比較

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲▲P<0.05，P<0.05。圖6 大鼠血清中IL-2、IL-6、IFN-γ含量的影響(n=10)

3.7 對大鼠血清中TNF-α與NO含量的影響

從表6、圖7可以看出，與正常組相比，模型組TNF-α與NO的含量極明顯升高(P<0. 01)；與模型組相比，柴胡龍骨牡蠣湯高劑量組與利培酮組TNF-α與NO的含量降低(P<0. 05)，差異具有統計學意義。

表6 大鼠血清中TNF-α與NO含量的影響

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲▲P<0.05，P<0.05。圖7 大鼠血清中TNF-α與NO含量的影響(n=10)

3.8 對大鼠血清中免疫球蛋白(IgG、IgM)的影響

從表7、圖8可以看出，相較于正常組，模型組血清IgG、IgM含量顯著性減少(P<0. 01)；相較于模型組，柴胡龍骨牡蠣湯高劑量組與利培酮組大鼠血清IgG和IgM的含量明顯升高(P<0. 01)；柴胡龍骨牡蠣湯中劑量組大鼠血清免疫球蛋白IgG含量升高(P<0. 05)，差異具有統計學意義。

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲▲P<0.05，P<0.05。圖8 大鼠血清中IgG與IgM含量的影響(n=10)

表7 大鼠血清中IgG與IgM含量的影響

3.9 對大鼠血清中SOD、MDA的影響

由表8、圖9可見，與正常組相比，模型組血清SOD含量明顯減少(P<0.01)，MDA含量明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，柴胡龍骨牡蠣湯高劑量組與陽性藥組大鼠血清SOD的含量明顯升高(P<0.01)，MDA含量明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，柴胡龍骨牡蠣湯中劑量組大鼠血清MDA含量降低(P<0.05)，差異具有統計學意義。

表8 大鼠血清中SOD、MDA含量的影響

3.10 對大鼠胸腺及脾臟指數的影響

由表9、 圖10可見，與正常對照組相比，模型組胸腺指數與脾臟指數有明顯下降(P<0.01)；相較于模型組，柴胡龍骨牡蠣湯高劑量組與利培酮組大鼠胸腺指數與脾臟指數升高(P<0.05)，利培酮組大鼠胸腺指數與脾臟指數也升高(P<0.05)，均具有統計學意義。

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲▲P<0.05，P<0.05。圖9 大鼠血清中SOD、MDA含量的影響(n=10)

表9 大鼠胸腺指數與脾臟指數的影響

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲▲P<0.05，P<0.05。圖10 大鼠胸腺指數與脾臟指數的影響(n=10)

4 討論

臨床及動物實驗研究表明，谷氨酸受體拮抗劑MK-801可誘導精神分裂癥模型大鼠行為學的改變[4]。本研究以MK-801為精神分裂癥的誘導劑，建立大鼠精神分裂癥模型，發現MK-801誘導的精神分裂癥模型大鼠出現刻板行為和共濟失調，表現出與精神分裂癥相似的的行為學改變。曠場實驗，是將實驗動物放置在新奇環境中，分析在該環境下動物的某些行為發生頻率和持續時間，最終反應出被測試的動物在陌生環境中的自主行為和探究行為。其中各項自發性活動指標能夠反映出大鼠的焦慮及精神不清樣行為。通過刻板反應與共濟失調結果，對精神分裂模型大鼠的狀態進行最直接評價，模型組較之于正常組各項指標均明顯降低，自發性活動明顯減少；而較之于模型組，柴胡龍骨牡蠣湯高劑量組與利培酮組對以上各指標的改善作用均具有統計學意義，顯示出兩組對精神分裂模型產生的焦慮不安及神志不清癥狀均具有一定的改善作用。在水迷宮實驗中，模型組的空間參考記憶較低，干預后柴胡龍骨牡蠣湯改善了這些認知能力，提示柴胡龍骨牡蠣湯能夠有效改善大鼠精神分裂癥的認知缺陷。

Schwarz M J等[5]研究發現,IL-2、IL-6、INF-γ以及免疫球蛋白(IgG、IgM)的生物學功能非常復雜，而且細胞的種類也比較多。在正常情況下，可以有效調節免疫應答，但是在病理狀態下，其濃度的升高，會對機體產生免疫性的病理損傷，同時也會促進其他種類細胞因子的生成，直接影響多巴胺、SHIT和去甲腎上腺素的神經遞質及下丘腦-垂體-腎上腺軸的激素，在精神分裂癥的發病機制中占重要地位。此次研究結果表明柴胡龍骨牡蠣湯可調節精神分裂癥大鼠體內IL-2、IL-6、INF-γ、IgG以及IgM水平，使之趨于正常，即改善精神分裂癥大鼠的癥狀。TNF-α是一種主要由單核巨噬細胞產生的細胞因子，常與其他細胞因子共同參與機體生長發育和維持內環境穩定，其主要功能是調節免疫細胞，在免疫應答的調控和炎癥的誘導等環節中起著關鍵作用[6]。李啟欣等[7]研究也發現發病的精神分裂患者血清TNF-α高于正常對照組。本研究中，模型組TNF-α較其他組均有所增加，表明柴胡龍骨牡蠣湯可降低精神分裂癥大鼠過高的TNF-α水平。NO作為體內的一種重要遞質，用于細胞間傳遞信息，主要存在于心血管系統，神經系統以及免疫系統[8]。研究表明NO在神經系統中具有雙向調節功能，可保護神經亦可對神經產生毒性。其中氧化型NO與N-甲基-D-天門冬氨酸受體(NMDAR)的琉基(SH)部分結合，導致NMDAR活性下降，通過抑制Ca2+內流進入細胞含量過高而產生毒性來保護神經功能[9]。而還原性NO可以使色氨酸、絡氨酸等酶失活而阻礙細胞正常代謝，從而引起脂質過氧化造成人體損害[10]。本研究中，模型組NO含量較其他組均有所增加，組間有差異，提示柴胡龍骨牡蠣湯對精神分裂大鼠血清NO有調節作用。

聶紅明等[11]研究發現SOD是機體內控制過氧化物水平的關鍵物質，該物質可以清除超氧陰離子自由基從而避免細胞過氧化物過多而引起的損傷。朱金華等[12]研究發現MDA是膜脂過氧化最重要的產物之一，在體內的含量可以反應出體內細胞的受損程度，是檢測體內過脂質氧化水平的一項重要指標表。經研究發現，精神分裂患者血液中的抗氧化物質與脂質過氧化物指標異常，可能是由于過氧化物質積蓄過多導致神經中毒而功能異常，可能是精神分裂癥發病的原因之一[13-14]。本研究中，柴胡龍骨牡蠣湯組較模型組SOD含量增多而MDA含量降低，表明柴胡龍骨牡蠣湯可提高SOD活性，抑制MDA生成，減少細胞損傷，減少氧自由基的累積。

胸腺和脾臟是機體重要的免疫器官，其中胸腺是T細胞分化、發育、成熟的地方，其功能與免疫密切相關；脾臟是機體發生特異性免疫的主要場所，產生大量淋巴細胞和巨噬細胞還可以制造免疫球蛋白和補體等免疫物質。胸腺指數和脾臟指數其數值高低可在一定程度上反應機體免疫功能的狀態。胸腺和脾臟出現萎縮退化導致免疫功能降低，是精神分裂癥的發病機制之一[15]。本研究結果表明柴胡龍骨牡蠣湯對改善精神分裂癥大鼠胸腺和脾臟在機體中的比重有積極作用。

總而言之，柴胡龍骨牡蠣湯能顯著提高精神分裂癥模型大鼠共濟失調，刻板反應及水迷宮測試中空間探索與定位分析的能力，改善精神分裂癥模型大鼠的異常行為活動，促進其回到正常的行為習慣。調節精神分裂癥模型大鼠血清中白介素、干擾素、免疫球蛋白、超氧化物歧化酶等含量，提高胸腺指數，脾臟指數。讓機體免疫因子在一定水平保持穩定，并提高精神分裂大鼠的免疫功能。