冠心病血瘀證對(duì)大鼠心肌能量代謝中關(guān)鍵酶的影響

馮宇，周曼麗，王健章，錢舒樂，張家齊，羅曉欣，蘭曉棟，金夢雨，簡維雄

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)，中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中醫(yī)心肺病證辨證與藥膳食療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208)

冠心病(Coronary heart disease,CHD)是冠狀動(dòng)脈病變引起管腔狹窄或阻塞，導(dǎo)致心肌缺血、缺氧后能量底物減少，ATP合成減少，葡萄糖、脂肪酸氧化失衡，心肌細(xì)胞形態(tài)受損，引起心肌功能異常，從而危害人類身體健康的疾病。有學(xué)者認(rèn)為這是一種能量代謝性疾病，且有實(shí)驗(yàn)表明在血液循環(huán)中當(dāng)血脂升高時(shí)，心肌能量代謝也已發(fā)生改變[1]。本實(shí)驗(yàn)前期證實(shí)能量代謝變化貫穿冠心病血瘀證這個(gè)由“血瘀證前期”向“亞血瘀證期”“心血瘀阻證期”流動(dòng)的過程[2-3]。為進(jìn)一步探討在冠心病血瘀證狀態(tài)下心肌能量代謝的調(diào)控規(guī)律，本次實(shí)驗(yàn)對(duì)冠心病血瘀證大鼠心肌能量代謝中關(guān)鍵酶的表達(dá)變化進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

選取160只清潔級(jí)SD健康大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220 g。大鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，在人工調(diào)控環(huán)境中飼養(yǎng)，相對(duì)濕度45%～70%，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～26 ℃，自動(dòng)燈光照明自上午8時(shí)至下午5時(shí)，自由飲食飲水1周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 造模和分組

將160只大鼠分為空白組和模型組，其中空白組30只，用于制備動(dòng)物模型組130只。參照以往研究基礎(chǔ)進(jìn)行動(dòng)物造模和模型評(píng)價(jià)[2]，分3個(gè)階段復(fù)制大鼠模型。

第一階段，建立“血瘀證前期”大鼠模型。首先運(yùn)用高脂飼養(yǎng)法復(fù)制高脂血癥大鼠模型。將3%膽固醇、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉、10%豬油、5%白糖、81.3%基礎(chǔ)飼料壓制成高脂飼料，每天對(duì)大鼠進(jìn)行飼喂。喂食7 d高脂飼料后，進(jìn)行維生素D3溶液(50萬IU/kg)灌胃，14 d后再進(jìn)行維生素 D3溶液(20萬IU/kg)灌胃。在造模第3周，選取10只空白組大鼠檢測血脂和血液流變學(xué)指標(biāo)，以空白組數(shù)值的95%參考值范圍作為正常值。造模大鼠隨機(jī)選取3只與空白組比較，血脂、全血黏度和血液流變學(xué)血漿黏度中的一項(xiàng)高于正常值，作為“血瘀證前期”模型成功標(biāo)志。從中隨機(jī)選取10只大鼠進(jìn)行腹主靜脈采血。在第一階段造膜有5只大鼠死亡。

第二階段，建立“亞血瘀證期”大鼠模型。在第12周，從第一階段成模大鼠中隨機(jī)選取3只大鼠，取主動(dòng)脈進(jìn)行HE染色檢測，將大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)持續(xù)增高、主動(dòng)脈動(dòng)脈斑塊形成作為模型成功的標(biāo)志(10只“血瘀證前期”模型血液流變學(xué)數(shù)值95%參考值范圍)。從中隨機(jī)選取10只大鼠腹主靜脈采血。同時(shí)抽取10只正常大鼠采集以上指標(biāo)作為對(duì)照。在第二階段造模有18只大鼠死亡。

第三階段，建立“心血瘀阻證期”大鼠模型。在已建立的“亞血瘀證”大鼠模型基礎(chǔ)上，參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行造模：①用10%水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉(0.4～0.6 mL/100g大鼠)，同時(shí)記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖；②大鼠氣管切開后接入人工呼吸機(jī)輔助呼吸(呼吸機(jī)的潮氣量為8～12 mL，頻率80次/分，呼吸比為1∶2),在第3～4肋骨間，距離胸骨左緣0.5 cm處作一約3 cm的縱行切口，從左側(cè)第4肋間鈍性分離皮膚、胸大肌、前鋸肌，將胸腔打開，顯出約1.2 cm的手術(shù)視野，將心臟暴露，剪開心包，在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳交界稍下1～2 mm處用無創(chuàng)傷縫線穿線，同時(shí)記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖；③結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，同時(shí)記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖；以穿線而未結(jié)扎者作為假手術(shù)大鼠；以結(jié)扎部位以下心肌變白、搏動(dòng)減弱且心電圖出現(xiàn)ST段弓背向上明顯抬高作為造模成功大鼠；④逐層縫合大鼠胸壁。第三階段造模有31只大鼠死亡。

1.3 指標(biāo)檢測

運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法檢測檸檬酸合成酶(citrate synthetase,CS)、己糖激酶(hexokinase,HK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)的酶含量。操作步驟如下：

1)制備標(biāo)本：各稱取不同階段的大鼠心肌組織，加入磷酸鹽緩沖液(pH值為7.4)，在4 ℃條件下充分勻漿，2 000～3 000 r/min離心20 min，收集上清液。根據(jù)試劑盒上的步驟檢測酶的濃度。

2)稀釋加樣標(biāo)準(zhǔn)品：按照說明書將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成5個(gè)梯度。

3)加樣：分別設(shè)置空白孔、待測樣品孔，在酶標(biāo)包被板上的待測樣品中先加樣品稀釋液，再加待測樣品。將一定稀釋的待測樣品加于酶標(biāo)板孔底部，輕輕搖晃混合均勻。用封板膜封板后，置于37 ℃溫育30 min，洗滌。

4)加酶標(biāo)抗體：除空白孔外，于各反應(yīng)孔中加入酶標(biāo)試劑。37 ℃溫育0.5～1 h，隨后洗滌。

5)加底物顯色：在各反應(yīng)孔中先加入顯色劑A，再加入顯色劑B，搖晃混合均勻，37 ℃避光顯色15 min。

6)終止反應(yīng)：在各反應(yīng)孔中加入終止液，終止反應(yīng)。

7)測定：將空白組調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的光密度值(OD)。測定在加入終止液后15 min內(nèi)進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

大鼠在冠心病血瘀證形成過程中心肌能量代謝酶的濃度變化如表1所示。血瘀證前期組與空白對(duì)照組關(guān)鍵酶濃度相比，CS、LDH濃度降低，HK濃度升高。亞血瘀證期組與血瘀證前期組關(guān)鍵酶濃度相比，CS、LDH濃度升高，HK濃度降低。心血瘀證期組與亞血瘀證期組關(guān)鍵酶濃度相比，CS、HK濃度升高，LDH濃度降低。

表1 各組心肌能量代謝關(guān)鍵酶含量的比較

3 討論

冠心病的最常見證型為血瘀證，其基本病機(jī)為“心脈不通”。有研究發(fā)現(xiàn)冠心病血瘀證發(fā)病與心肌細(xì)胞能量代謝密切相關(guān)，其基本病理為心肌缺血[4]。心肌缺血引起心肌細(xì)胞氧供與氧耗失衡，導(dǎo)致葡萄糖無氧酵解增加、細(xì)胞酸中毒及乳酸堆積[5]。而能量代謝是疾病的一種反應(yīng)形式，病情在變化，能量也隨之變化。本課題組前期證實(shí)冠心病血瘀證是一個(gè)“血瘀證前期”→“亞血瘀證期”→“心血瘀證期”的流動(dòng)過程[2]。因此，闡明心肌細(xì)胞能量代謝在冠心病血瘀證狀態(tài)下的調(diào)控變化規(guī)律，有助于從整體上動(dòng)態(tài)分析冠心病心血瘀證的形成過程和機(jī)理。

近年來，有許多研究證實(shí)在冠心病起始階段的高脂血癥時(shí)期，心肌的能量代謝就已受到影響。高紅莉等[6]在研究中發(fā)現(xiàn)血液中脂質(zhì)水平升高影響了心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，引起心肌ATP酶活性降低。謝益明[7]通過實(shí)驗(yàn)證明在高血脂狀態(tài)下有異常的心肌能量代謝，心肌對(duì)能量底物的利用產(chǎn)生改變。由此可見，在冠心病血瘀證前期血脂開始升高時(shí)，心肌能量代謝已發(fā)生變化。在本實(shí)驗(yàn)心血瘀證前期組中，相較空白對(duì)照組CS、LDH濃度降低，HK濃度升高。CS是一種關(guān)鍵的代謝調(diào)節(jié)酶，可催化乙酰輔酶A和草酰乙酸合成檸檬酸鹽和輔酶A，決定乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)(TCA)的速率，在有氧代謝能量的產(chǎn)生中起著重要的作用[8-10]。LDH存在于機(jī)體組織細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，是參與糖酵解和糖異生中氧化還原反應(yīng)的重要酶。在心肌組織代謝中，LDH催化乳酸為丙酮酸，從而為檸檬酸循環(huán)提供能量。HK是六碳糖的磷酸化酶，催化葡萄糖從穩(wěn)定狀態(tài)變?yōu)榛钴S狀態(tài)的葡萄糖-6-磷酸，是糖酵解中的限速酶。在冠心病血瘀證前期，LDH、CS濃度降低，HK濃度升高。其原因可能是冠心病血瘀證前期血脂升高，脂肪酸代謝異常。正常心肌細(xì)胞脂肪酸攝取、利用平衡，高脂血癥形成時(shí)，心肌細(xì)胞攝取、利用的脂肪酸增加，心肌攝入的脂肪酸超過其氧化能力，而脂肪酸的增加會(huì)激活蛋白激酶C，抑制葡萄糖的攝取、利用[11]。有研究發(fā)現(xiàn)在高脂肪飲食小鼠中會(huì)出現(xiàn)胰島素信號(hào)缺陷，導(dǎo)致心肌葡萄糖利用減少[12]。

冠心病亞血瘀證期，大鼠主動(dòng)脈斑塊形成,動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型建立。LDH、CS濃度升高，HK濃度降低。動(dòng)脈粥樣硬化由脂質(zhì)代謝紊亂引起，心肌脂肪酸β氧化增多，過量的活性氧(reactive oxygen species, ROS)產(chǎn)生引起氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激是體內(nèi)氧化與抗氧化失衡，通過氧化誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙，促進(jìn)局部炎癥[13]。Xu等[14]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中內(nèi)皮細(xì)胞的糖酵解水平下降。

冠心病心血瘀阻證期，大鼠出現(xiàn)心肌缺血、缺氧，HK、CS濃度升高，LDH濃度降低。無氧代謝作用的增強(qiáng)可能是機(jī)體受到缺血、缺氧的損傷而啟動(dòng)的代償機(jī)制。心肌缺血、缺氧后，氧供與氧耗失衡，致使線粒體生成ATP減少，葡萄糖無氧酵解增加。LDH濃度降低，說明乳酸受催化形成的丙酮酸減少，乳酸利用減少導(dǎo)致其在細(xì)胞內(nèi)堆積，使細(xì)胞內(nèi)酸中毒加重。在正常心肌細(xì)胞內(nèi)，控制內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定主要通過調(diào)節(jié)酶的活性來實(shí)現(xiàn)，特別是限速酶的調(diào)節(jié)。有研究顯示在急性心肌缺血狀態(tài)下，心肌能量代謝中對(duì)葡萄糖的利用率會(huì)上升[15-16]。當(dāng)心肌缺血、缺氧后，葡萄糖攝取量和利用率增加，HK激活，糖酵解作用加速以提供有限的ATP，維持重要酶的活性。糖酵解重要的生理意義就在于當(dāng)心肌缺血缺氧時(shí)，能迅速提供能量。線粒體是細(xì)胞中產(chǎn)生能量的細(xì)胞器，冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎后，氧含量降低會(huì)迅速導(dǎo)致線粒體功能障礙。CS濃度的升高可能是心肌細(xì)胞為改善線粒體功能增加對(duì)能量的需求。在蛋白-代謝組的關(guān)聯(lián)性分析中發(fā)現(xiàn)在血瘀證重型組伴隨著血液高凝狀態(tài)及三羧酸循環(huán)加速[17]。

本實(shí)驗(yàn)研究了冠心病血瘀證大鼠形成過程中關(guān)鍵酶的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)CS濃度先降低后升高，LDH濃度呈現(xiàn)“降低→升高→降低”的趨勢，HK呈現(xiàn)“升高→降低→升高”的趨勢。結(jié)果提示冠心病血瘀證形成過程中伴隨著心肌能量的變化，從血瘀證前期就有三羧酸循環(huán)、糖酵解參與能量代謝。然而，本實(shí)驗(yàn)測定的酶有限，不能完整說明冠心病血瘀證形成過程中的心肌能量代謝，后期需結(jié)合更多能量代謝指標(biāo)進(jìn)行研究。