自體富血小板血漿聯合少陽生骨方治療大鼠膝關節軟骨 缺損的實驗研究

王波，高海明，曹家全，瞿剛波，鄧莉，吳佳奇*

(1.西南醫科大學中西醫結合學院，四川 瀘州 646000；2.西南醫科大學附屬中醫醫院，四川 瀘州 646000)

0 引言

各種創傷和骨病造成的關節軟骨缺損在臨床中常見，因此治療關節軟骨缺損是現代骨科領域研究的重點。目前對于軟骨損傷修復辦法主要有：組織工程修復、微骨折術[1,2]、軟骨細胞移植術(autologous chondrocytes implantation，ACI)[3]等。但上述方法對于修復較大、較深的軟骨缺損療效尚不理想。隨著血小板濃縮生物的發展，富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)為治療關節軟骨缺損提供新的途徑。富血小板血漿是全血通過離心獲得的含高濃度血小板的血漿成分[4]。PRP 因富含生物活性因子被廣泛應用于再生醫學和組織修復領域的臨床和實驗研究[5,7]。目前眾多研究顯示PRP 在修復關節軟骨缺損、促進軟骨再生方面具有獨特作用。近年來，中醫藥的發展受到重視，我院使用少陽生骨方治療關節軟骨缺損取得較好療效。PRP 與少陽生骨方均能有效治療關節軟骨缺損，然而PRP 與少陽生骨方聯合運用是否能進一步促進缺損關節軟骨的修復目前未見報道。本研究擬分析PRP 與少陽生骨方聯合運用修復缺損關節軟骨的療效，以期為臨床治療關節軟骨缺損提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑及儀器

4 周齡SD 實驗大鼠20 只，體重(300g±10g)，雌雄各半，均由西南醫科大學動物實驗中心提供。

4%多聚甲醛(國藥集團化學試劑有限公司)；PBS 磷酸鹽緩沖液(北京中杉金橋生物技術有限公司)；無水乙醇(成都科龍化工試劑廠)；二甲苯(天津致遠化學試劑有限公司)；伊紅染液、蘇木素染液(珠海貝索生物技術有限公司)；檸檬酸鹽緩沖液(北京中杉金橋生物技術有限公司)；甲苯胺藍(上海如吉生物科技發展有限公司)；collagen Ⅰ、collagen Ⅱ (proteintech 公司，美國)。

轉輪式切片機( 徠卡-2016，德國)；PHY- Ⅲ型病理組織漂烘儀器、TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機(常州市中威電子儀器有限公司)；BMJ-Ⅲ型包埋機(常州郊區中威電子儀器有限公司)；數碼三目攝像顯微鏡(BA400Digital，麥克奧迪實業集團有限公司)；圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics 公司，美國)。

1.2 PRP 制備

采用改良的PCCS kit 法[8]無菌提取PRP，具體過程為：取SD 實驗大鼠眶后靜脈血3.0 mL 加入預先放置10%構椽酸鈉抗凝劑的離心管中，離心3 000 r·min-1，3 min 45 s，吸取上層血漿及血小板，再次離心，3 000 r·min-1，13 min，棄上層清液，將剩余液體與激活劑(凝血酶與10% CaCl 2 的混合物)適當比例震蕩，混勻，血凝塊充分收縮后再離心，1 500 r·min-1×15 min，吸取全部上清液即為PRP 液。

1.3 模型建立

各大鼠適應性飼養3 天，觀察各大鼠均生存良好，術前10小時禁食、禁飲。具體手術過程：10%聚維酮碘常規腹部消毒后，以3%戊巴比妥(1mL/100g)腹腔注射麻醉大鼠，麻醉滿意后大鼠取仰臥位固定于手術臺上，選取右側膝關節以4%硫化鈉脫毛，以10%聚維酮碘消毒右下肢皮膚，鋪巾后進行手術。膝關節取伸直位，于髕骨內側依次切開皮膚、皮下組織直達關節囊，分離關節囊進入關節腔，向外側翻開髕骨并屈膝，充分暴露股骨滑車，于股骨滑車正中以一2.0mm 克氏針垂直關節平面轉孔至有落空感為止，邊轉邊用生理鹽水沖洗，避免局部熱損傷，反復沖洗關節腔后依次縫合關節囊、皮下組織、皮膚，常規消毒后無菌敷料包扎傷口，術畢。手術均由本人及固定助手完成。術后觀察各大鼠飲水、攝食、活動情況，每日常規傷口換藥，術后兩周傷口拆線。見圖1。

圖1 制備大鼠關節軟骨缺損模型 a.暴露髕股關節；b.造模；c.造模完成后

1.4 少陽生骨方劑量計算

少陽生骨方由柴胡10g、半夏10g、黨參10g、黃芩6g、骨碎補10g、懷牛膝6g、大棗6g、甘草6g 組成(由西南醫科大學附屬中醫醫院制劑室提供)，依照參考文獻并以臨床成人有效用藥量，按照Meeh-Ruber 公式，大鼠所需藥物劑量g=人所需藥物劑量g.m-1X 大鼠體表面積(大鼠體表面積=K*W(體重)2/3×10-4)，K 為常數：小白鼠和大鼠為9.1，豚鼠為9.8，家兔為10，人為10.6，計算出大鼠給藥劑量作為大鼠與成人的等效劑量，10 倍等效劑量為實際灌胃量[9]。100g 大鼠少陽生骨方組給藥量為8.5g/d(濃縮至含生藥4g/mL 的藥液，100g 大鼠每天需要量為2.2mL/d)。

1.5 實驗分組及干預方法

將造模成功的20 只大鼠隨機分為A 組(空白對照組)、B組(PRP 組)、C 組(少陽生骨方組)、D 組(PRP+少陽生骨方組)，采取不同干預措施，A 組：不采取干預措施；B 組：關節腔注射PRP；C 組：灌胃少陽生骨方；D 組：關節腔注射PRP+灌胃少陽生骨方。

1.6 觀測指標

1.6.1 大體標本觀察

術后3 月脫頸處死各組大鼠，取各組實驗大鼠患肢修復組織，大體觀察缺損處修復情況，包括修復組織的色澤、形態、組織彈性、表面光滑度，觀察修復處組織的大體形態及與周圍組織的愈合情況。

1.6.2 HE 染色觀察

術后3 月脫頸處死各組大鼠，獲取術側關節軟骨缺損處組織，以10%多聚甲醛固定標本24h，EDTA 脫鈣液脫鈣1 周，固定組織經全自動脫水機脫水，石蠟包埋，輪轉式切片機切片，染色后經下觀察，采用數碼三目顯微攝像系統對切片進行圖像采集，每張切片先于40 倍下觀察全部組織，觀察大體病變，選擇要觀察區域采集100 倍和400 倍圖片，觀察具體病變。

1.6.3 甲苯胺藍染色觀察

標本經上述固定、脫鈣、包埋切片處理后，將切片置于甲苯胺藍染色液中染色30 min，然后以蒸餾水反復漂洗并在冰醋酸中分化數秒，再用蒸餾水沖洗2 次，冷風吹干，乙醇梯度脫水后二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察軟骨組織病理變化。

1.6.4 免疫組化檢測Ⅰ型膠原及Ⅱ型膠原表達

標本經上述固定、脫鈣、包埋切片處理后，加入抗體顯色后，采用數碼三目顯微攝像系統進行圖像采集，鏡下觀察Ⅰ膠原、Ⅱ型膠原表達。

1.6.5 通過平均光密度分析Ⅱ型膠原表達量

上述所收集圖像采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統測定所采集全部圖像的光密度(integrated optical density，IOD)和面積，并計算出3 張圖像的平均光密度，通過平均光密度分析Ⅱ型膠原表達量。

1.7 統計學方法

采用SPSS 17.0 統計軟件進行分析，數據以均數±標準差表示，以Levene 法行方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-α 法；檢驗水α=0.05。

2 結果

2.1 大體標本觀察

術后第3 月脫頸處死各組大鼠，大體觀察缺損軟骨修復情況。A 組缺損面清晰可見，缺損處見少量淡黃色組織填充，缺損表面不整齊，與周圍軟骨組織界限明顯；B 組軟骨缺損處可見半透明樣組織軟組填充，缺損未完全填滿，缺損處表面較光滑，與周圍軟骨組織界限較明顯；C 組軟骨缺損處可見半透明樣組織填充，缺損未完全填滿，缺損處表面較粗糙，與周圍軟骨組織界限較清晰；D 組軟骨缺損處可見近透明樣組織填充，缺損近填滿，缺損處表面光滑，與周圍軟骨組織界限較模糊。見圖2。

2.2 HE 染色觀察

HE 染色示，A 組修復組織內軟骨細胞數量明顯減少，排列紊亂；B、C 組軟骨細胞數量減少，排列較紊亂，軟骨表層較粗糙；D 組軟骨細胞數量明顯增多，可見軟骨陷窩，排列緊密，軟骨表面較光滑。見圖3。

2.3 甲苯胺藍染色觀察

甲苯胺藍染色示，A 組未見明顯正常關節軟骨基質分泌；B組見細胞內有少量紫色異染顆粒存在，有正常軟骨基質分泌；C組見細胞內有少量紫色異染顆粒存在，細胞周圍少量正常軟骨基質分泌；D 組見細胞內有大量紫色異染顆粒，近正常軟骨基質分泌，接近正常關節軟骨細胞。見圖4。

圖2 術后3 月各組大體標本觀察，箭頭所示為缺損處修復情況a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組

圖3 術后3 月各組HE 染色觀察(×400) a. A 組；b .B 組；c. C 組；d. D 組

圖4 術后3 月各組甲苯胺藍染色觀察(×400) a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組

圖5 術后3 月各組免疫組化染色觀察Ⅰ型膠原(×400) a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組

圖6 術后3 月各組免疫組化染色觀察Ⅱ型膠原(×400) a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組

2.4 免疫組化觀察Ⅰ型膠原及Ⅱ型膠原表達

Ⅰ型膠原檢測示，A 組見少量Ⅰ型膠原表達，B、C、D 組未見明顯Ⅰ型膠原表達。Ⅱ型膠原檢測示，A 組軟骨修復組織中Ⅱ型膠原少量表達；B 組、C 組軟骨修復組織中可見較多Ⅱ型膠原表達；D 組軟骨修復組織中細胞內及細胞外Ⅱ膠原表達明顯增加，出現黃褐色或棕黃色顆粒，修復組織中細胞同周圍軟骨及軟骨結合良好。見圖5、圖6。

2.5 通過平均光密度分析Ⅱ型膠原表達量

D 組Ⅱ型膠原表達量高于A 組、B 組、C 組，差異有統計學意義(P＜0.05)；A 組Ⅱ型膠原表達量低于B 組、C 組，差異有統計學意義(P＜0.05)；B 組、C 組之間差異無統計學意義(P＞0.05)。

表1 Ⅱ型膠原表達量統計結果( ±sD)

表1 Ⅱ型膠原表達量統計結果( ±sD)

注：a：以A 組為對照組，P＜0.05；b；以B 組為對照組，P＜0.05；c 以C 組為對照組，P＜0.05。

組別 N(只) MOD(images/BZ_15_1128_1554_1154_1582.png ±sD)A 組 3 0.2469±0.0048 B 組 3 0.2566±0.0058a C 組 3 0.2597±0.0035a D 組 3 0.2761±0.0055abc F 值 14.004 P 值 0.002

3 討論

關節軟骨在關節活動中起重要作用，其表面光滑，能減少相鄰兩骨的摩擦，緩沖運動時產生的震動[10]。關節軟骨為透明軟骨，是一種無血管、淋巴及神經分布的結締組織，其由軟骨細胞和細胞外基質構組成，二者相互依存，相互作用。其中細胞基質由水、膠原和蛋白多糖組成，水占軟骨容量的65%-80%[11]，三者使關節面具有抗變形能力和剛性。膠原是關節軟骨的主要成分和張力的決定性因素[12,13]。正常人關節軟骨中有Ⅱ、Ⅵ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ型5 種膠原，它們共同組成的軟骨內纖維網架結構[14]，約占關節濕重的30%。其中Ⅱ型膠原是構成關節軟骨的主要成分，約占90%-95%。通常以3 條Ⅱ型膠原纖維構成螺旋分子，排列規則[15]。

PRP 中富含高濃度的血小板，多種生長因子與纖維蛋白原[16]，PRP 所含的各種生長因子相互作用，可與靶細胞表面的受體結合，激活細胞的信號通路，誘導細胞產生傷口愈合所需的各種蛋白質，誘導細胞增殖、調整細胞排列形態，促進骨樣組織及膠原合成[17]。而纖維蛋白原在凝血酶作用下可緩慢聚合，釋放出內部生長因子，有利于發揮生長因子間的協同作用，增進組織修復效果。PRP 通過活化后釋放的各種生物活性因子和血漿中的各種蛋白發揮促進損傷關節軟骨修復的作用，如能夠刺激軟骨細胞增殖，促進骨髓間充質干細胞等骨軟骨前體細胞遷移、增殖、向軟骨分化和分泌軟骨細胞基質，抑制損傷部位炎癥反應，刺激滑膜細胞分泌透明質酸和關節滑液，形成凝膠為損傷部位提供早期修復并為前體細胞創造增殖、分化的三維環境等[18]。PRP 治療關節軟骨缺損已運用于臨床，但對于較大、較深的關節軟骨缺損的修復效果尚不理想。

隨著中醫藥的發展，我院運用少陽生骨方治療關節軟骨缺損取得了較好療效。祖國醫學《黃帝內經》中明確提出“少陽主骨”的觀點，《素問·熱論》云：“少陽主骨”，《靈樞·經脈》記載”足少陽之脈主骨所生病”。“少陽生骨方”以“小柴胡湯”加減而成，方組由柴胡、半夏、黨參、黃芩、骨碎補、懷牛膝、大棗、甘草組成，以小柴胡湯為基礎可和解少陽，通利膽經，消除痹痛，同時輔以骨碎補、懷牛膝補益肝而達到和補共用作用。研究表明少陽生骨方能調節大鼠軟骨細胞中Ⅱ型膠原、基質金屬蛋白酶13 的m RNA 和蛋白的表達水平、可顯著降低關節液中導致軟骨細胞損傷的炎性介質IL-1β 水平，提高軟骨損傷后修復組織中Ⅱ型膠原的表達，從而有助于軟骨損傷的修復[19,20]。此外少陽生骨方能促進去分化軟骨細胞的增殖，促進SD 大鼠在體軟骨損傷后軟骨的修復，且修復組織更接近透明軟骨[21,22]。

本實驗研究結果顯示PRP 與少陽生骨方聯合運用組對想缺損關節軟骨修復效果明顯優于PRP、少陽生骨方單獨應用組，在一定程度上佐證了PRP 與少陽生骨方聯合運用會進一步促進缺損關節軟骨組織修復。我們認為其機制可能為PRP 與少陽生骨方對缺損關節軟骨組織的修復作用產生協同效應。本研究在實驗指標上選擇Ⅰ型膠原Ⅱ型膠原來確定膠原表達的類型來說明療效，因為Ⅱ型膠原是關節軟骨的正常表型。本研究結果顯示各組修復組織中未見明顯Ⅰ型膠原表達，PRP 與少陽生骨方聯合運用組Ⅱ型膠原表達量明顯高于其他組，證實了修復組織為軟骨組織而不是瘢痕組織，且PRP與少陽生骨方聯合運用組修復效果優于其他各組。但值得注意的是，中藥復方具有多成分，代謝多途徑，作用多靶點等特點，其藥理作用是每個有效成分的疊加、協同或互補。

綜上述，PRP 與少陽生骨方聯合運用能發揮協同效應，進一步促進缺損關節軟骨組織的修復，但具體機制有待進一步研究明確。

作者貢獻：王波直接參與實驗設計、實施、數據收集及統計分析，文章撰寫；高海明直接參與實驗實施及數據收集；曹家全直接參與實驗實施、材料購買；瞿剛波參與實驗指導；鄧莉參與數據統計分析；吳佳奇設計實驗，并對文章的知識性內容作批評性審閱。

利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。基金項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及報道。

機構倫理問題：本研究方案獲西南醫科大學倫理委員會批準(2020-071)。實驗動物使用許可證號：SYXK(川)2013-065。