補(bǔ)腎活血祛風(fēng)方對(duì)阿霉素腎病大鼠尿蛋白、血脂、凝血影響的研究

余海龍，詹華奎，張嬿，畢榕

（1.西南醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610072）

0 引言

糖皮質(zhì)激素作為原發(fā)性腎小球疾病的重要藥物，但應(yīng)用中卻存在激素抵抗或不敏感現(xiàn)象，同時(shí)也存在副作用，如增加脂代謝紊亂,血液高凝狀態(tài)等。本研究以臨床效驗(yàn)方“補(bǔ)腎活血祛風(fēng)方”對(duì)阿霉素大鼠進(jìn)行干預(yù)，探討本方對(duì)腎小球疾病治療的綜合作用，探索本方增強(qiáng)激素效果、減輕副作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠（Sprague Dawley）170 只，重（200±20）g，由成都達(dá)碩生物公司提供（合格證號(hào)：NO51203500001792）。

1.2 藥物及制備

補(bǔ)腎活血祛風(fēng)方所含中藥飲片有熟地黃、山茱萸、生黃芪、丹參、炒僵蠶、蟬蛻、地龍、全蝎，夠自四川省中藥材飲片公司，制成每毫升含1.35g 生藥的藥液。鹽酸多柔比星（海正輝瑞制藥有限公司，批號(hào)：16002011）。醋酸潑尼松片（浙江仙琚制藥有限公司，批號(hào)：33021207）。

1.3 造模

大鼠適應(yīng)性飼喂后，代謝籠收集每只大鼠24h 尿液，測(cè)定24 小時(shí)尿蛋白量，小于10mg 的標(biāo)記后選用。造模：鹽酸多柔比星（阿霉素）分兩次尾靜脈注射，按重量初次用量為4mg/kg，第8 天再次注射，用量3.5mg/kg，空白組使用生理鹽水同法注射，末次注射后的第3 周末收集24 小時(shí)尿液，測(cè)定24 小時(shí)尿蛋白，大于100mg 為合格，同時(shí)隨機(jī)選取4 只大鼠采血測(cè)定血白蛋白和血脂，出現(xiàn)低白蛋白，高血脂提示造模成功。

1.4 分組及干預(yù)

設(shè)空白組，待造模成功后，隨機(jī)數(shù)字法增分模型組、潑尼松組、中藥組、中藥+潑尼松組，每組23 只（根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每組預(yù)備3 只），確保分組無(wú)差異。空白組正常喂養(yǎng)，模型組蒸餾水，潑尼松組醋酸潑尼松片溶液，中藥組補(bǔ)腎活血祛風(fēng)湯劑，中藥+潑尼松組上午給予潑尼松，下午給予中藥。湯劑用量根據(jù)大鼠體重按13.47g/kg/d 給藥，潑尼松根據(jù)體重按6mg/kg/d 給藥。各干預(yù)組每天灌胃給藥1 次。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

（1）一般情況：記錄體重、習(xí)性活動(dòng)、飲水?dāng)z食、二便等。

（2）尿蛋白：第4 周末每組隨機(jī)選定10 只大鼠，代謝籠收集24 小時(shí)尿液，德國(guó)西門子公司生化分析儀（ADVIA2400）及試劑檢測(cè)24 小時(shí)蛋白尿。8 周末重復(fù)測(cè)定。

（3）血液指標(biāo)：8 周末，每組隨機(jī)抽取10 只大鼠，水合氯醛400mg/kg 用量腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血，用上海特康科技公司全自動(dòng)生化分析儀（TC6010L）及試劑，測(cè)定血白蛋白（ALb）、膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）；凝血分析儀及配套試劑測(cè)定大鼠凝血酶原時(shí)間 (PT), 凝血酶時(shí)間 (TT), 部分凝血活酶時(shí)間 (APTT)。同時(shí)摘取腎臟，HE 染色觀察病理改變。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 21.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用表示。滿足參數(shù)檢驗(yàn)條件的組間比較選用T 檢驗(yàn)，多組間用OnewayANOVA 單因素方差分析；不符合條件者用非參檢驗(yàn)，組間比較用Mann-Whitney，兩兩比較選Nemenyi。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

空白組大鼠體重增長(zhǎng)快，皮毛色澤、精神活動(dòng)、攝食排便等無(wú)特殊。模型組皮毛逐漸枯槁，活動(dòng)萎靡，尾部不同程度水腫或潰爛，攝食減少，體重增速減慢，部分門齒斷裂、松脫。各治療組上述癥狀相對(duì)輕，潑尼松組出現(xiàn)興奮，狂躁，部分可見(jiàn)腹部或肢體水腫。除空白組，其余各組均有大鼠死亡，模型組死亡2 只，潑尼松組死亡3 只，中藥組死亡2 只，中藥加潑尼松組死亡3 只。

2.2 尿蛋白情況

造模后各組24 小時(shí)尿蛋白均高于空白組（P＜0.05），造模各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示造模成功，分組具有可比性。在第4 周末時(shí)各干預(yù)組及模型組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在8 周末中藥+潑尼松組、激素組尿蛋白均低于模型組（P＜0.05），中藥+ 潑尼松組低于潑尼松組和中藥組，激素組低于中藥組，但三組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)義（P＞0.05）。對(duì)不同時(shí)間和不同用藥組做交互分析，呈現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=4.228,P=0.001）。

表1 24h 尿蛋白定量比較（mg/24h， ±s）

表1 24h 尿蛋白定量比較（mg/24h， ±s）

注：＊為與空白組相比，P＜0.05；△：與模型組相比，P＜0.05

組別 數(shù)量 造模后 4 周末 8 周末空白組 10 6.26±1.65 17.75±3.04 17.35±4.13模型組 10 187.99±45.84＊ 271.28±136.63＊ 502.52±217.51＊潑尼松組 10 211.12±61.60＊ 233.69±90.15＊ 296.44±114.17＊△中藥組 10 201.71±60.33＊ 294.82±100.76＊ 359.71±128.58＊中藥+潑尼松組 10 210.15±86.54＊ 250.89±134.41＊ 281.12±130.10＊△

2.3 血脂指標(biāo)

空白組白蛋白高于其他組，與模型組、激素組、中藥+激組相比，P＜0.05，與中藥組相比，P＞0.05。甘油三酯：中藥組低于各干預(yù)組，且與激素和激素+中藥組比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。膽固醇：中藥組低于各干預(yù)組，且與中藥加激素組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P＜0.05）。

2.4 凝血指標(biāo)

空白組白PT 長(zhǎng)于其他組，P＜0.05，其余四組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。中藥+ 潑尼松組APTT 明顯長(zhǎng)于其余各組，P＜0.05，其余各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。空白組TT 長(zhǎng)于其余各組（P＜0.05），潑尼松組TT 明顯低于模型組，P＜0.05，其余各組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 8 周末TG、TC 比較( ±s)

表2 8 周末TG、TC 比較( ±s)

注：＊為與空白組相比，P＜0.05；▽表示與中藥組相比，P＜0.05。

組別 例數(shù) TG（mmol/L） TC（mmol/L）空白組 10 0.29±0.14 1.01±0.29模型組 10 8.18±8.92＊ 5.62±3.68＊潑尼松組 10 13.9±10.04＊▽ 5.84±3.38＊中藥組 10 4.40±3.58＊ 5.34±2.79＊中藥+潑尼松組 10 13.29±7.50＊▽ 8.30±3.99▽＊

表3 8 周末各組大鼠凝血指標(biāo)比較( ±s)

表3 8 周末各組大鼠凝血指標(biāo)比較( ±s)

注：＊為與空白組相比，P＜0.05；▽為與模型組相比，P＜0.05；△為與中藥+ 潑尼松組比，P＜0.05

組別 例數(shù) PT（s） APTT（s） TT（s）空白組 10 11.64±0.63 19.52±1.46△ 29.85±4.64模型組 10 9.78±0.75＊ 19.34±1.44△ 28.27±2.54＊潑尼松組 10 10.26±1.06＊ 20.40±1.61△ 25.50±4.01＊▽中藥組 10 10.04±1.28＊ 19.28±0.88△ 27.21±7.92＊中藥+潑尼松組 10 9.93±0.38＊ 21.80±1.38 26.96±13.04＊

3 討論

補(bǔ)腎活血祛風(fēng)方根據(jù)著名中西醫(yī)結(jié)合腎臟病專家葉傳蕙教授經(jīng)驗(yàn)化裁而成，葉老在治療蛋白尿時(shí)強(qiáng)調(diào)祛風(fēng)通絡(luò)，提出“風(fēng)邪不去，蛋白不消”的觀念。風(fēng)為百病之長(zhǎng)，可兼寒夾熱，淺則襲皮毛腠理，深則入臟腑經(jīng)絡(luò)，與風(fēng)、濕、熱、瘀膠滯[1]。此時(shí)祛風(fēng)能起到滌蕩諸邪之效，但草木之品恐難觸及深處之邪，故選用僵蠶、全蝎、蜈蚣、蟬蛻等能搜剔入絡(luò)的蟲(chóng)類藥搜風(fēng)通絡(luò)，剔動(dòng)深固于內(nèi)的邪氣。再者，脾腎久損，易夾肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)，而上述藥物則又可平息內(nèi)風(fēng)，滌痰通絡(luò)。必要時(shí)酌情聯(lián)合使用糖皮質(zhì)激素可減少尿蛋白，同時(shí)能減輕激素副作用，改善代謝[2-3]。黃淑芬教授在治療慢性腎臟疾病蛋白尿時(shí)，也重視腎絡(luò)瘀阻、玄府閉塞的病機(jī)，并且認(rèn)為瘀久可生風(fēng)，創(chuàng)造性的提出了“治血先治風(fēng)”的理論，運(yùn)用蟲(chóng)類藥開(kāi)通玄府，祛風(fēng)通絡(luò)、活血舒絡(luò)，對(duì)慢性腎臟病尿蛋白有較好緩解[4-5]。

蛋白尿是多類腎小球疾病，尤其是腎病綜合征的典型表現(xiàn)，而這一過(guò)程又會(huì)反過(guò)來(lái)加重腎臟病變，比如觸發(fā)炎癥因子過(guò)度表達(dá)和脂代謝紊亂，或?qū)ο的ぜ?xì)胞和腎小管產(chǎn)生毒性。本實(shí)驗(yàn)中，模型組尿蛋白增加明顯，4 周末時(shí)各干預(yù)組尿蛋白低于模型組，而潑尼松組最低，起效快，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，到8周末時(shí)潑尼松組、中藥加潑尼松明顯低于模型組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明在一定治療周期基礎(chǔ)上潑尼松、和中藥加潑尼松能對(duì)尿蛋白有改善作用，遺憾的是其余各干預(yù)組之間比較并未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但交互分析顯示不同時(shí)間和尿蛋白具有交互作用，說(shuō)明隨著觀察時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，可能差體現(xiàn)更明顯。也推測(cè)可能與24 小時(shí)尿蛋白受尿量影響過(guò)大有關(guān)系，有研究[6-8]表明尿蛋白/肌酐比值與尿蛋白定量有較好相關(guān)性，能反映腎臟病變，對(duì)于本模型后續(xù)研究有一定借鑒意義。另一方面，腎臟的病理改變是影響腎臟功能的關(guān)鍵因素，雖然中藥加潑尼松組尿蛋白在統(tǒng)計(jì)學(xué)上未呈現(xiàn)差異，但中藥加潑尼松組病理改變是相對(duì)輕的，這可能是本方的另一優(yōu)勢(shì)所在。

高脂血癥與系膜細(xì)胞增生，炎癥因子釋放，高凝狀態(tài)及血栓形成及腎小管間質(zhì)纖維化，腎小球硬化發(fā)展有關(guān)[9-10]。本實(shí)驗(yàn)除空白組，均出現(xiàn)了明顯血脂紊亂，潑尼松組、中藥加潑尼松組TG 明顯高于中藥組，說(shuō)明激素的應(yīng)用可能會(huì)加重TG紊亂，單用中藥不引起阿霉素大鼠TG 升高，這與某些關(guān)于僵蠶、蟬蛻、地龍等蟲(chóng)類藥物對(duì)血脂作用的研究相吻合[11-13]。但本方中二者合用與單用激素相比并未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)優(yōu)勢(shì)，可能是受到激素對(duì)脂代謝的過(guò)強(qiáng)干擾，同時(shí)也不排除與實(shí)驗(yàn)后期各組動(dòng)物因門齒斷裂等因素造成進(jìn)食差異有關(guān)，特別是中藥加激素組動(dòng)物進(jìn)食情況好于激素組。

腎病綜合征常常伴有高凝狀態(tài)，這增加血栓形成及栓塞發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，特別是在大量尿蛋白的情況下更突出，對(duì)患者預(yù)后有影響，所以改善高凝和防治血栓是腎病綜合征患者治療的重要內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)中模型組凝血時(shí)間和空白組相比均有縮短的現(xiàn)象，符合疾病特點(diǎn)。各組PT 時(shí)間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，中藥加潑尼松組APTT 高于其余各組，激素組TT 低于模型組，說(shuō)明中藥不引起TT 縮短，中藥和潑尼松合用可以延長(zhǎng)APTT，在一定程度上有利于改善高凝狀態(tài)。

所以本方在應(yīng)用時(shí)可能不僅僅體現(xiàn)于改善蛋白尿，而是包括了改善脂代謝、高凝狀態(tài)在內(nèi)的多項(xiàng)綜合效果，而這些又是腎纖維化基礎(chǔ)的影響因素[14]，所以這可能對(duì)于改善長(zhǎng)期預(yù)后具有一定意義。當(dāng)然本實(shí)驗(yàn)也存在一些局限性，如觀察周期相對(duì)短，尿量影響大，中藥劑量未分高低組等，尚可在指標(biāo)優(yōu)化、胞內(nèi)藥物濃度、改善血脂紊亂等方面深入實(shí)驗(yàn)和臨床研究，進(jìn)一步闡明本方的作用。