尿液相關生物標志物預測新生兒壞死性小腸結腸炎手術時機研究進展 *

胡曉渝 綜述，李祿全 審校

(重慶醫科大學附屬兒童醫院新生兒診治中心/國家兒童健康與疾病臨床醫學研究中心/兒童發育疾病研究教育部重點實驗室/兒童發育重大疾病國家國際科技合作基地/兒科學重慶市重點實驗室,重慶 400014)

新生兒壞死性小腸結腸炎(NEC)是新生兒期嚴重的消化道急癥，隨著經濟和診療技術的提高，其發病率也呈上升趨勢[1-3]。Ⅲ期NEC治療難度大，往往需要手術治療。且時機過早，對患兒的生長發育有顯著影響；切除過晚，影響預后[4-5]，因此精準把握手術時機十分重要。目前，主要依據臨床特征性表現、生化指標異常、影像學特征性表現及治療效果不佳4個方面來確定手術時機[6]。但由于NEC發病具有隱匿性且病情進展較快，往往難以及時且準確地進行判斷，影響治療。目前，有研究發現，代表腸道損傷嚴重程度的特異性生物標志物能夠反映NEC的病情變化，輔助評估手術時機。糞便鈣衛蛋白、血漿α-腸抑蛋白等相關標志物可以早期預測手術時機已在多項研究中得以證實[7-8]。但NEC患兒大多禁食時間長[9]，大便量少，標本收集困難，檢測準確性難以保證。血清學檢查為入侵性操作，增加感染風險。而尿液檢查標本易獲得且不對患兒造成創傷，可以作為更好的選擇。本文綜述NEC患兒尿液相關的生物標志物在預測手術時機中的價值，為選擇最佳手術時機提供參考依據。

1 尿腸源性脂肪酸結合蛋白(I-FABP)

脂肪酸結合蛋白是一種小的胞質蛋白，在小腸和結腸中參與脂肪酸的運輸。正常情況下，早產兒出生后體內I-FABP水平較低，并隨日齡緩慢增加[10]。但在腸細胞膜完整性喪失時被釋放到循環中，尤其在小腸缺血受損時能夠迅速通過細胞膜、毛細血管、毛細淋巴管及門靜脈進入血循環，被腎臟清除，最終以尿液形式排出體外[11]。NEC患兒發病及病情進展與腸道發育不成熟、腸黏膜的高免疫反應、腸道缺血、缺氧等相關，其主要病理改變為腸道黏膜損傷。這提示I-FABP能夠作為腸細胞損傷的標記，反映NEC患兒腸道受損程度。多項研究表明，手術組NEC患兒尿I-FABP高于非手術I-FABP水平且具有特異性[11-15]。THUIJLS等[13]對50例懷疑腸缺血的患者的尿液進行酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測后發現，被確診為腸缺血的患兒尿I-FABP水平明顯高于對照組，且與缺血嚴重程度相關，這提示尿I-FABP在判斷NEC患兒缺血程度方面有重要價值。SCHURINK等[14]對疑似NEC患兒每8小時測量1次尿液I-FABP水平，從疑似開始，持續至少48 h或直到手術時，結果表明I-FABP水平在癥狀出現后24 h內最高，之后隨著時間的推移有逐漸下降的趨勢。同時，該研究發現，手術組NEC嬰兒的I-FABP水平明顯高于非手術組。EVENNETT等[12]對外科新生兒重癥監護病房的Ⅱ/Ⅲ期NEC患兒尿I-FABP測定結果表明尿液I-FABP水平升高與更廣泛的腸道受累有關。COUFAL等[15]也證實尿I-FABP急劇增加的NEC患兒病情更容易發展為Ⅲ期。這為監測NEC病情變化，判斷疾病嚴重程度及預后提供了重要依據。

因此，作為一種判斷腸缺血及腸道受累程度的指標，尿I-FABP對NEC的診斷及病情判斷方面具有重要意義。加之其測定可依靠ELISA法完成，檢測方法準確、簡單、方便，這使得尿I-FABP在評估NEC患兒手術時機具有良好的應用前景。

2 肝臟脂肪酸結合蛋白(L-FABP)

L-FABP是一種小分子(14～15 kDa)組織特異性胞漿蛋白，在腸上皮細胞、肝細胞、腎小管細胞、胰腺和肺中高表達，參與脂肪酸的代謝。L-FABP在腸道中的組織分布與I-FABP相似，但L-FABP在結腸中的表達低于I-FABP[16]。在腸道細胞死亡過程中，I-FABP和L-FABP都被釋放到循環中，因此可以作為腸道損傷的標志[17-18]。MITIDIERO等[17]對新生NEC大鼠的肝臟和回腸L-FABP表達檢測，免疫組織化學和蛋白質印跡均顯示，NEC組肝臟中L-FABP表達降低，回腸L-FABP表達水平升高，這表明L-FABP表達與腸道損傷有關，可用于NEC診斷。COUFAL等[15]研究提示，在最終發展為NEC的患兒中，尿液L-FABP水平迅速升高，且高于對照組，術后6 h NEC患兒的 L-FABP的水平也明顯高于非手術組，說明尿L-FABP能夠反映NEC的發生及病情變化。但該研究受限于樣本量太小，需進一步擴大樣本容量提高準確性。而且目前專門針對尿L-FABP與腸道損傷及NEC的研究較少，多數研究在尿I-FABP測定的同時進行L-FABP測定，或聯合其他生物標志物來判斷腸道損傷。因此仍需進一步研究來證明尿L-FABP作為NEC診斷及預后判斷方面生物標志物的價值。

3 緊密連接蛋白(Claudins-2、Claudins-3)

Claudins-2、Claudins-3是在腸道中高表達的特異緊密連接蛋白，由胞內、胞外蛋白組成的一個大型復合體組成。Claudin 2已被鑒定為多種器官中的成孔蛋白，在腸道中與腸道通透性密切相關[19]。NEC患兒腸壁完整性喪失，上皮屏障功能障礙，持續的炎癥刺激誘導Claudin在腸道、腎臟等組織過表達[20-21]，因此采用免疫印跡法檢測尿中Claudin-2和 Claudin-3含量有助于NEC診斷[22-23]。有研究對臨床懷疑NEC的新生兒進行每天尿量測定，發現診斷為NEC的患兒尿液中代表腸壁完整性喪失的Claudin-3水平顯著升高；發現尿Claudin-2較非NEC組明顯增高，且NEC病情發生急劇變化時，Claudin-2水平可升至原來的2倍，這提示Claudin在判斷NEC病情變化、治療方案選擇等方面有重要意義[24]。這些研究結果為NEC診斷及治療提供了新的思路，發現新的無創性生物標志物，為評估手術時機提供重要參考。但目前NEC導致尿液Claudin緊密連接蛋白升高具體機制尚不清楚，相關研究有限，須進一步深入研究探討其臨床應用可能性。

4 血清淀粉樣蛋白A(SAA)

SAA是一種急性時相反應性蛋白，表達于肝臟和腸道等多種組織，可能在調節腸道炎癥中發揮作用。NG等[25]根據血漿SAA創立的APOSAA評分可有效識別NEC病例并進行風險分級，為NEC早期準確診斷提供參考。SAA分子結構小，能夠通過腎臟以尿液的形式排出體外，因此尿液SAA一定程度反映血漿SAA水平，有助于NEC診斷。CETINKAYA等[26]分別在0、24、48 h及7、10 d測定尿SAA水平，結果表明NEC組SAA水平顯著高于對照組(P<0.05)，證實了尿SAA在早期診斷NEC方面的價值。REISINGER等[27]的研究也表明，NEC組患兒尿液中SAA明顯高于非NEC組患兒，且NEC組診斷后到手術時，SAA水平有升高趨勢。COUFAL等[15]研究表明需要外科手術干預的NEC患兒尿液SAA水平明顯高于僅需要內科治療者，提示尿SAA能夠預測NEC病情發展，為手術時機選擇提供依據。因此，尿SAA測定不僅在早期無創性診斷中有用，還在以后的NEC治療監測中也有應用價值。但作為一種炎性反應的預測因子，SAA在NEC診斷方面缺乏特異性，需結合其他生物標志物共同進行判斷[15]。

5 前列腺素E2主要尿代謝物(PGE-MUM)

前列腺素E2是花生四烯酸酶促氧化的產物，是腸黏膜炎癥的生物標志物，可以反映腸道黏膜損傷嚴重程度，研究表明血漿和黏膜前列腺素E2隨結腸損傷程度的升高而升高[28]。但血液中PGE-2的半衰期很短，難以精確測量體液中PGE-2水平，對炎癥水平進行準確判斷。有研究發現，尿中主要的PGE-2代謝物(PGE-MUM)含量穩定，并被報道為一種有用的藥物腸黏膜炎癥的生物標志物，反映成人和兒童潰瘍性結腸炎[28]。ARAI等[29]對PGE-MUM和C反應蛋白在反映潰瘍性結腸炎病情活動方面進行對比分析發現，PGE-MUM在病情進展及緩解具有較高特異度和靈敏度。KONISHI等[30]進一步檢測了NEC患兒、其他疾病和健康嬰幼兒尿液中的PGE-MUM水平，發現PGE-MUM水平可反映嬰兒NEC的病情和嚴重程度，NEC組PGE-MUM2最高，其水平與NEC病情嚴重程度、腸壞死長度、Bell分期相關。此研究為首次報告NEC中PGE-MUM水平的研究，提示PGE-MUM水平可能是反映NEC疾病病情嚴重程度的有用替代生物標志物。但此研究樣本量較小，且未對手術組NEC患兒的PGE-MUM水平進行測定，因此需要更大的樣本量來證實其相關性及是否能用來評估手術風險。

6 三葉因子-3 (TFF-3)

TFF-3在腸道中表達，與維持黏膜屏障完整性、促進黏膜屏障重建、胃腸道炎癥和細胞遷移有關[31]。NAKOV 等[31]在對潰瘍性結腸炎患者TFF-3水平進行測定后發現，TFF-3可作為潰瘍性結腸炎黏膜修復的標志，這說明TFF-3能夠反映腸道炎癥的轉歸，提示預后。COUFAL等[15]等采用ELISA法測定NEC患者尿液中的TFF-3，結果顯示需要外科治療的NEC患者尿TFF-3水平高于內科NEC患者，提示TFF-3水平與腸道損害程度有關，為TFF-3預測手術時機提供了依據。此外，在NEC動物模型中，TFF-3可能通過調節相關因子表達來保護過度的細胞凋亡，從而發揮其對腸道損傷的保護作用[32]。但目前基于尿液TFF-3的研究甚少且樣本量較小，相關研究多集中在血漿，且取得一定成果。NG等[33]聯合L-FABP，I-FABP和血漿TFF-3建立的LIT評分在NEC診斷及死亡率預判等方面靈敏性和特異性均較高，這為尿液TFF-3的相關研究提供了方向，但仍需要進一步探討。

7 補體C5a

補體激活產物C5a是導致腸系膜缺血/再灌注損傷的促炎因子，過度的補體激活能夠導致腸道炎癥，成為NEC發病的易感因素。TAYMAN等[34]發現，NEC患者的C5a水平顯著高于對照組且比其他參數更準確，在預測死亡和診斷時手術需求方面具有較高價值。這表明了補體C5a測定在NEC診斷和病情評估方面的價值。REISINGER等[27]進一步測定29例NEC新生兒(內科治療組12例，外科手術/致死組17例)尿液C5a，結果發現C5a水平僅在6例患者中檢測到。由于在大多數尿樣中未檢測到補體激活產物，無法計算出可靠的統計差異。但值得注意的是，這6例患者均屬于外科手術/致死組，這為尿液C5a預測NEC病情發展及手術時機的選擇提供了方向。因此，尿液C5a在預測NEC外科手術時機的價值方面有待進一步研究。

8 尿代謝組學

代謝組學是一種在生物樣本中同時進行大量分析，檢測生物體中一整套代謝物(內源性和外源性)的方法[35]，是一種非常有前途的醫學生物標志物檢測工具。這些代謝物描述了生物體在正常和病理條件下的狀態，并可與特定的生化途徑相聯系。因此，可通過研究新生兒尿液中與NEC相關的代謝物的變化[37]，為尋找相關生物標志物提供線索[37]。TOMAIDOU等[38]前瞻性地收集了15例患病早產兒(5例Bell′s Ⅰ期和10名Ⅱ/Ⅲ期)的尿液樣本，以及相同數量的匹配對照組。對108種尿代謝物進行鑒定，共鑒定出25種有價值的代謝物，分別屬于氨基酸、有機酸、糖和維生素。該研究發現NEC新生兒和對照組新生兒的代謝特征有明顯差異，且NEC各期患兒尿代謝產物存在明顯不同。其中，酪氨酸、精氨酸和核黃素在鑒別NEC方面具有較高價值。且NEC患兒的氨基酸相關生化途徑受到了較大影響。THOMAIDOU等[38]對抗生素治療和未經抗生素治療的NEC仔豬的尿代謝組進行分析后發現，二者存在統計學差異，提示尿代謝組學能夠反映NEC的轉歸程度及預后。這為將尿液代謝組學引入臨床診療實踐，判斷NEC的發生、發展及手術時機的選擇提供了新的思路。但目前相關研究大多僅停留在動物實驗階段，臨床研究樣本量較小(n=15)，還需要進一步研究驗證。

9 小 結

NEC是影響早產兒和低出生體重新生兒的胃腸道最嚴重的疾病之一，但目前NEC的病因及發病機制尚不明確，其診斷多依靠臨床表現及影像學，缺乏特異性強、靈敏度高的指標對NEC的發生、發展及預后進行及時且準確的判斷。相關生物標志物檢查為診斷NEC及手術治療時機的選擇提供了良好的依據。作為一種方便易得的生物標本，部分尿液相關生物標志物特異度、靈敏度高，具有較高的臨床應用價值。但目前沒有一種單一的生物標志物在臨床實踐中被證明是有用的獨立診斷測試，相關研究的樣本量均較小，其臨床應用價值仍待商榷，需擴大規模研究闡明其潛在應用價值尤其是NEC手術時機的選擇方面。臨床研究表明，多種生物指標聯合應用在判斷NEC病情變化方面具有重要意義，這為NEC相關尿液標志物的研究提供了新的方向，需要進一步深入研究為臨床應用提供依據。