沙門菌核酸檢測試劑盒評價

陳賽閣,付 盼,何磊燕,張 蕾,王愛敏,李春玲,王傳清

復旦大學附屬兒科醫院細菌室，上海 201102

感染性腹瀉是指各種細菌、病毒、真菌、寄生蟲感染引起腸道炎癥所致的急、慢性腹瀉，是全球最常見的一類疾病，相關調查顯示，中國感染性腹瀉的年發病頻率約為0.9次/人，5歲以下兒童的年發病頻率則為2.1次/人[1]，因此加強對小兒感染性腹瀉的防控顯得尤為重要。另有研究表明沙門菌是小兒感染性腹瀉的主要病原菌[2]。沙門菌是一種革蘭陰性腸桿菌，也是腸桿菌科中最主要的食源性致病菌，蛋、家禽和肉類產品是沙門菌的主要傳播媒介[3]。目前，主要通過傳統培養法即標本增菌、分離培養、生化及血清學鑒定試驗檢測臨床標本，此方法準確且可靠性高，但它操作復雜、檢測周期長，所需試劑繁多，具有一定的局限性[4]。由于沙門菌傳染性強，易引起暴發或者流行，個別重癥患者病情進展快，尤其是兒童，易發生死亡，因此沙門菌的檢測需要向快速檢測技術轉變[5]。沙門菌和志賀菌檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)基于PCR原理以及Taqman熒光探針技術，采用三色熒光PCR在全封閉的擴增體系中檢測沙門菌和志賀菌的特異性基因片段，從而實現對標本的多重、快速檢測；在體系中檢測內參基因，對待測標本核酸的提取及擴增進行全程監控，可以防止假陰性的出現；同時使用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶)和脫氧尿苷三鱗酸(dUTP)，避免擴增產物污染。本研究對此產品的多項性能指標進行了評價，旨在評估產品質量和有效性。

1 材料與方法

1.1標本來源 將2018年5月至2018年11月于本院門診就診且臨床診斷為感染性腹瀉的患者標本納入研究。感染性腹瀉診斷標準參照《諸福棠實用兒科學》相關章節[6]。剔除無法進行溯源的病例標本、非本院來源的病例標本、重復病例的標本。

1.2儀器與試劑 木糖-賴氨酸-脫氧膽酸(XLD)平板、亞硒酸鹽磺綠(SBG)沙門菌增菌液、沙門菌顯色平板(CAS平板)、Cary-Blair氏運送培養基均購自上海科瑪嘉微生物技術有限公司；克氏雙糖和腸道發酵管(Ⅱ)為本實驗室自配，ABI7500型實時熒光定量PCR儀為美國應用生物系統公司產品，核酸提取試劑盒、沙門菌和志賀菌核酸檢測試劑盒為上海速創診斷產品有限公司的產品。

1.2方法

1.2.1腸道沙門菌、志賀菌培養及鑒定 挑取Cary-Blair氏運送培養基中的膿血、黏液樣糞便，或直腸拭子，接種于XLD平板上，將平板于35 ℃培養18～24 h后觀察菌落。同時將沾有標本的棉簽在SBG增菌液中洗脫，增菌液于35 ℃培養18～24 h后觀察有無顏色變化，將過夜后變色渾濁的增菌液轉種XLD平板，于35 ℃培養18～24 h后觀察菌落。沙門菌：挑取XLD平板上中央帶有黑心的2個以上菌落，接種于克氏雙糖和腸道發酵管(Ⅱ)和CAS平板，35 ℃孵育18～24 h后觀察其生化反應和CAS平板上顏色變化；對疑為沙門菌的進行沙門菌血清凝集試驗，若A-F多價血清呈陽性，根據O抗原、H抗原凝集結果確定沙門菌名稱。志賀菌：挑取XLD平板上無色透明的2個以上菌落，接種于克氏雙糖和腸道發酵管(Ⅱ)和CAS平板，35℃孵育18～24 h后觀察其生化反應和CAS平板上顏色變化；對疑為志賀菌的，進行志賀血清凝集試驗，若4種多價血清呈陽性，根據單價血清凝集結果確定志賀菌名稱。

1.2.2沙門菌的血清學檢測 首先用可疑菌與沙門菌O多價血清Vi抗原(A-F)進行凝集，若呈明顯凝集，提示被檢菌株可能屬于A-F 6個O群范圍之內，可根據本省O因子檢出頻率的順序，按O4、O9、O7、O8、O10、O19、O2、O11的順序進行凝集。再用H因子血清第一相(特定相)定型，最后用H因子第二相(非特異型)輔助定型。若生化反應符合沙門菌的表型，但A-F多價血清不凝集(有可能是傷寒和丙型副傷寒)，首先考慮是否存在表面抗原(Vi抗原)，因為Vi抗原能阻斷O抗原與相應的抗體發生凝集，加熱可將其破壞。此時應將細菌制成菌懸液，放入沸水中加熱15～30 min，冷卻后再做凝集試驗。若去除Vi抗原后仍不凝集，此時應考慮Vi抗原是否為A-F以外菌群，應送專業實驗室進行鑒定。

1.2.3腸道沙門菌、志賀菌PCR-熒光探針法檢測 (1)試劑準備：從(-20±5)℃取出試劑盒，試劑盒中主要包括沙門志賀PCR反應液、沙門志賀酶混合液、沙門志賀內標物、沙門志賀陰性對照(0.9%氯化鈉溶液)和陽性對照(含滅活的沙門菌和志賀菌)。將各試劑于室溫下溶解，充分混勻并短暫離心后使用。取N個(N=陰性對照數+陽性對照數+待檢測樣本數)PCR反應管，每管按照要求依次加入沙門志賀PCR反應液19 μL和沙門志賀酶混合液1 μL，總體積20 μL，用于1份標本的檢測。(2)標本處理：挑取米粒大小糞便，放置于含有1 mL生理鹽水的離心管中，用強力振蕩器高速振蕩2 min，取200 μL轉移至一新的離心管中，12 000 r/min離心2 min后棄上清液，同時取200 μL陰性對照和陽性對照，12 000 r/min離心 2 min后棄上清液；往各標本以及陰性對照、陽性對照的沉淀中加入200 μL核酸提取液(使用前充分振蕩混勻)、10 μL沙門志賀內標物以及1管提取固形物，用強力振蕩器高速渦旋振蕩5 min；瞬時離心，100 ℃干浴5 min，然后12 000 r/min離心2 min，取5 μL上清液用于PCR擴增。(3)加樣：在準備好試劑的PCR反應管中分別加入待測標本、陰性對照和陽性對照上清液各 5μL，蓋緊管蓋后，瞬時低速離心。(4)PCR擴增：根據標本類型設置標本編號、陰性對照和陽性對照，每個標本選擇沙門菌檢測通道(FAM)，志賀菌檢測通道(ROX)和內參檢測通道(JOE)3個通道。反應條件設定：UDG酶處理37 ℃ 5 min；預變性95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 45 s，共40個循環。進行擴增檢測，待檢測結束后，記錄結果。

1.2.5交叉反應 取一定濃度輪狀病毒或諾如病毒病原體加入標本保存液中，與常規標本一樣處理，重復3次。

1.2.6抗干擾能力 本試驗根據臨床需求，評估標本運送培養基對檢測結果的影響。試驗組為弱陽性標本；對照組加入等量的運送培養基，與常規標本一樣處理；重復測定3次。

1.3統計學處理 采用SPSS20.0軟件進行統計分析，得出受試者工作特征曲線(ROC曲線)的曲線下面積(AUC),計算診斷靈敏度、特異度、約登指數、Kappa值。

2 結 果

2.1入組患者基本信息 共隨機入組196例患者，留取其糞便標本共196例，其中女86例、男110例，年齡0～16歲，中位年齡為2歲。196例糞便標本中沙門菌或志賀菌培養陽性75例(本院志賀菌陽性極少，試驗期間未收集到志賀菌陽性標本，因此此試驗中陽性標本均為沙門菌陽性)，沙門菌和志賀菌培養陰性121例。

2.2沙門菌血清型分布 75株沙門菌中鑒定到種占86.70%，共監測到9種血清型，其中鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌占72.00%，見表1。

表1 75株沙門菌血清型分布

2.3PCR-熒光探針法檢測結果及效果評價 糞便培養法陽性率為38.26%(75/196)，核酸檢測試劑盒陽性率為37.24%(73/196)，兩種方法符合率為92.86%(182/196)。沙門菌核酸檢測試劑盒診斷靈敏度為89.33%，診斷特異度為95.04%，約登指數為84.37%，Kappa值為0.85，ROC曲線下面積為0.93，與培養結果有極好的一致性。見表2。

表2 試劑盒檢測沙門菌與培養法的比較(n)

2.4精密度分析結果 試驗結果顯示CV值為10.11%，精密度良好。

2.5交叉反應結果評價 加入輪狀病毒或諾如病毒病原體的樣本檢測結果為陰性，此試劑盒與輪狀病毒和諾如病毒無交叉反應。

2.6抗干擾能力結果評價 弱陽性樣本檢測仍為弱陽性結果，對照組結果為陰性，此結果顯示此試劑盒抗干擾能力強，其檢測結果不受運送培養基的影響。

3 討 論

沙門菌屬分腸道沙門菌和邦戈沙門菌兩種，腸道沙門菌有鞭毛，不產生芽孢，無莢膜，為兼性厭氧的革蘭陰性腸道桿菌[7]。沙門菌也是引起我國食源性疾病和食物中毒的主要病原菌之一[8],每年我國大約有3億人因感染沙門菌而患病，其引起的疾病達到我國食源性疾病總數的70%～80%[9]。兒童細菌性腹瀉是比較常見的一種消化道綜合征，其發病原因與多種因素有關，其中最主要的是病原菌感染，主要臨床癥狀為大便性狀變化、大便次數增多等，腹瀉嚴重時可能導致患兒營養不良，從而影響到患兒的生長發育甚至可引起死亡。在我國，多項研究表明引發兒童細菌性腹瀉的最主要病原菌就是沙門菌屬[10-12]。為此，建立快速、有效的檢測方法對預防和控制沙門菌感染非常重要。

目前沙門菌的檢測方法包括傳統檢測方法、免疫學檢測方法、分子生物學方法等[13]。傳統檢測法通過對標本分步增菌以達到提高病原菌檢出率的目的，主要步驟有標本增菌、分離培養、生化及血清學分型鑒定。此方法準確且可靠性高，但它操作復雜、檢測周期長，鑒定至少需要4 d[14]，所需試劑繁多，在敏感性、特異性和檢測速度等方面有自身的局限性。免疫學檢測方法一般是應用抗體或抗原與相應的抗原和抗體特異性結合的原理檢測待測標本是否含有待測物質[15]。已經建立的沙門菌免疫學檢測方法包括：酶聯免疫吸附測定(ELISA)法、免疫熒光法、免疫層析技術等。這些檢測方法具有操作簡便、特異性高、檢測成本低、分析容量大等優點，缺點是靈敏度低、不易定量，并且會出現假陽性、假陰性等問題。沙門菌分子生物學檢測方法有PCR、環介導等溫擴增技術(LAMP)、核酸探針技術(NAP)、基因芯片技術等。這四種方法具有簡便快速、靈敏度高、特異性強等優點，現已廣泛應用于微生物檢測等諸多領域。但是，由于這些方法技術含量高，對儀器和操作人員的要求較高，因此很難在基層廣泛推廣。

本試驗使用的沙門菌核酸檢測試劑盒與“金標準”培養法比較，無須標本增菌、分離培養、生化及血清學鑒定等步驟，只需挑取標本，用配套核酸提取試劑提取核酸，進行PCR擴增即可，1.5～2.0 h即可判斷是否有沙門菌感染。本試驗結果顯示，與“金標準”培養法相比，沙門菌核酸檢測試劑盒診斷靈敏度為89.33%，診斷特異度為95.04%，精密度良好，約登指數為84.00%，Kappa值為0.85，ROC曲線下面積為0.93，與培養結果有極好的一致性。與輪狀病毒、諾如病毒不會發生交叉反應，Cary-Blair氏運送培養基也不會干擾本試劑盒的檢測。

但此試劑盒也存在著一定的局限性：不能對沙門菌進行血清分型鑒定；標本采集、轉運或保存不當可能會導致假陰性結果；沙門菌、志賀菌待測靶序列的變異可能會導致假陰性結果；未經驗證的其他干擾或PCR抑制因子可能會導致假陰性結果。實驗室環境污染、試劑污染、標本交叉污染可能會出現假陽性結果。

綜上所述，本研究中使用的沙門菌和志賀菌核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)能準確檢測沙門菌感染，可作為診斷沙門菌感染以及流行病調查的一種方法。