通過生物信息學分析鑒定干燥綜合征的關鍵基因

郭俊愷 趙承磊 趙興旺 王 娟 葛 蘭 宋志強 游 弋

陸軍軍醫大學第一附屬醫院皮膚科，重慶，400038

干燥綜合征(Sjogren’s syndrome, SS)是一種慢性自身免疫性疾病，中年女性好發，發病率為0.1%～0.6%[1,2]。其臨床表現可分為兩類：外分泌腺表現和腺體外表現。外分泌腺主要累及淚腺和唾液腺，常引起眼、口干燥。腺體外可累及皮膚、關節、肺、胃、腎等臟器[3,4]。SS的病因目前尚不明確，可能與遺傳和環境因素的復雜相互作用有關，目前認為SS與自身抗原Ro/SSA和La/SSB導致的異常免疫反應有關[5-7]。

隨著高通量測序和微陣列技術的發展，生物信息學已用于篩選各種疾病中的差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)[8]。為了深入探討SS的發病機制，本研究對基因數據庫中下載的GSE23117和GSE127952的基因表達譜進行了分析，鑒定關鍵DEGs，分析它們在SS發病過程中的潛在途徑，為研究SS的發生和發展提供一些新的思路。

1 材料與方法

1.1 芯片數據信息 從基因數據庫(NCBI-GEO)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲得GSE23117和GSE127952的基因表達譜。GSE23117的數據來自GPL570平臺[Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array]的芯片，用于研究SS和非SS患者不同炎癥程度的小唾液腺的基因表達，我們分析其中10個SS小唾液腺標本和4個健康對照小唾液腺樣本；GSE127952來自GPL20995平臺[Agilent-019415 Human and Custom Viral Transcript Array 1.2]的芯片，用于研究SS患者和健康志愿者在小唾液腺中基因表達譜的差異，包括8個SS小唾液腺樣本和6個健康對照小唾液腺樣本。NCBI-GEO屬于國際公共公開的基因表達數據庫，用于幫助科研工作者們查詢和下載實驗以及精選的基因表達譜。

1.2 DEGs的數據提取 SS和健康對照腺體樣本的DEGs均來自GEO2R網站，取|logFC|>2，P值<0.05。logFC>2的DEGs被視為上調基因，而logFC<-2的DEGs被視為下調基因。用Venn在線工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)篩選出GSE23117和GSE127952中共同的上調和下調DEGs，并用Heml 1.0軟件分別繪制GSE23117和GSE127952共同DEGs的熱圖。

1.3 PPI圖譜和關鍵基因的獲取 使用在線工具STRING (https://string-db.org/)用于評估PPI網絡信息。然后通過下載Cytoscape軟件研究DEGs之間的潛在關系，利用Cytoscape軟件的MCODE(Degree Cutoff=2，Max. Depth=100, K-Core=2, Node Score cutoff=0.2)應用程序來獲得關鍵的候選基因。最后應用David Gene(http://david.abcc.ncifcrf.gov)功能分類工具分析GO和KEGG途徑。

2 結果

2.1 SS小唾液腺樣本中DEGs的鑒定 在這項研究中，我們分別對GSE23117(10個SS小唾液腺樣本和4個健康對照小唾液腺樣本)和GSE127952(8個SS小唾液腺樣本和6個健康對照小唾液腺樣本)的數據集進行了分析。通過GEO2R在線工具，我們分別從GSE23117和GSE127952中提取了658和155個DEGs。利用Venn圖分析了31個重疊的DEGs，這些重疊基因包括28個上調基因和3個下調基因，并用Heml 1.0軟件繪制重疊DEGs熱圖(表1，圖1、2)。

縱軸代表基因，橫軸中SS為病例組，HC為對照組

表1 重疊的DEGs

2.2 功能和途徑的基因分析 使用David軟件探索31個DEGs的功能和途徑。功能分析的結果表明，在生物學過程(BP)中，上調的DEGs在炎癥反應、免疫反應、脂多糖反應、白細胞趨化性正向調節、趨化因子介導的信號通路、細胞-細胞信號傳導、cAMP代謝過程正向調節、cAMP介導的信號傳遞正向調節、細胞增殖調節和干擾素-γ負向調節中聚集。在細胞成分(CC)分析中，上調的DEGs聚集在質膜的外部和細胞外區域。在分子功能(MF)分析中，上調的DEGs在絲氨酸型內肽酶活性、趨化因子活性和CXCR趨化因子受體結合中富集(表2)。

表2 干燥綜合征功能的基因分析

2.3 KEGG分析的結果 分析結果提示在細胞因子-細胞因子受體相互作用，趨化因子信號傳導途徑，阿米巴病和白細胞跨內皮遷移等通路明顯富集(表3)。

表3 干燥綜合征差異表達基因的KEGG分析

2.4 PPI和模塊化圖片 建立DEGs的PPI網絡(圖3)。使用Cytoscape軟件MCODE應用程序來顯示9個中心節點(CXCL9，CXCL11，CXCL13，CCR1，CD69，PTPRC，GPR183，MMP9和IL10)的結果(圖4)。

圓圈代表基因，線代表基因之間的PPI，圓圈內的結果代表蛋白質結構

方塊代表基因，結果顯示9個關鍵基因

3 討論

在本研究中，對BP的GO功能分析顯示，上調的DEGs主要集中在炎癥、免疫、對脂多糖(LPS)的反應、白細胞趨化性的正調節和趨化因子介導的信號通路等方面。SS是一種與炎癥介質、細胞浸潤密切相關的自身免疫性疾病[9]。既往研究中LPS刺激唾液細胞可上調TLR 4的表達和免疫調節分子的表達，這在SS的唾液腺炎癥反應中起著重要的作用[10]。SS患者唾液中細胞因子/趨化因子的濃度明顯高于對照組[11]。這與我們分析的結果類似。CC分析中，DEGs主要集中在細胞質膜外區域和細胞外間隙。MF分析中，絲氨酸型內肽酶活性、趨化因子活性和CXCR趨化因子受體結合中富集。KEGG分析提示DEGs通路與細胞因子-細胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路、白細胞跨內皮遷移和阿米巴病有關。SS發病機制的研究表明，T淋巴細胞和B淋巴細胞對自身抗原的異常反應導致細胞因子和趨化因子水平升高，引起腺泡慢性炎癥并最終導致其生理功能的喪失[7]。阿米巴滋養體可以誘導IL-10的產生[12]。IL-10的表達在抵抗阿米巴病侵襲的黏膜屏障中發揮重要的作用[13]。同時作為一種具有重要免疫調節功能的抗炎細胞因子，IL-10在SS患者的唾液腺中高表達,通過釋放免疫介質和抗原呈遞來抑制單核細胞和巨噬細胞的免疫功能[14,15]。

PPI和模塊分析表明，CXCL9、CXCL11、CXCL13、CCR1、CD69、PTPRC、GPR183、MMP9和IL10基因顯著富集。這9個關鍵基因主要可以分為三大類：一是細胞因子及趨化因子基因，包括IL10、CXCL9、CXCL11、CXCL13、CCR1。IL10作為重要的抗炎細胞因子，在自身免疫疾病的發生和發展中起著重要作用[16]，IL-10的rs3024505變體是干燥綜合征的易感等位基因[17]。CXCL9、CXCL11、CXCL13屬于趨化因子配體家族，在SS患者唾液中濃度高出正常人，提示與唾液腺的大量淋巴細胞聚集密切相關[11]。CCR1是一種趨化因子受體，與細胞浸潤、活化、組織損傷和炎癥有關。SS患者B淋巴細胞中CCR1的表達上調，可能與B淋巴細胞的干擾素信號有關[18]。在KEGG分析中，我們發現IL10、CXCL9、CXCL11、CXCL13和CCR1主要參與細胞因子與胞嘧啶受體的相互作用和趨化因子信號通路，這可能提示趨化因子在SS中的異常表達使外分泌細胞浸潤，導致外分泌腺功能障礙[19]。二是免疫相關基因，包括CD69，MMP9。CD69是II型跨膜糖蛋白，與其交聯可產生細胞內信號傳導及多種免疫反應，與血液系統疾病及免疫性相關疾病的發病機理有關。SS患者中活化的CD3/CD69T細胞百分比增加，在組織的炎性級聯中起重要作用[20]。MMP9也稱為明膠酶B，屬于基質金屬蛋白酶家族。MMP9基因被證明與自身免疫的病理生理過程有關[21]。MMP9的增加或許與唾液腺結構完整性的退化有關，導致唾液生成減少[22]。三是其它基因，包括PTPRC，GPR183。PTPRC的蛋白質產物是蛋白質酪氨酸磷酸酶(PTP)家族的成員，在細胞生長、分化、有絲分裂和致癌轉化中起著重要作用[23]。PTPRC基因與SS有關，可能參與基因甲基化[24]。GPR183又稱EB病毒誘導分子2(EBI 2)，GPR183主要在B細胞中表達并誘導細胞遷移和增殖[25]。在SS患者腺上皮曾發現EB病毒顆粒,在SS患者血清中也發現過EB病毒抗體[26]。我們的研究一定程度上支持病毒感染可能是SS的激發因素。

綜上所述，DEGs主要通過細胞因子-細胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路等調控炎癥、免疫參與SS的發病機制。我們推測篩選的9個關鍵DEGs在SS的發生和發展中起著重要作用，可能為研究SS的表面靶點和生物學機制提供一些新思路和方向。