食源性致病微生物快速檢測技術的發展趨勢及研究進展

◎ 范 蕊，王文文，盧 彬

（新疆維吾爾自治區分析測試研究院，新疆 烏魯木齊 830011）

食品衛生安全問題是全球各個國家都普遍關注的重要內容，是人們日常生活和社會穩定發展的重要條件，而微生物所造成的食源性疾病則成為影響食品安全衛生的關鍵一環。

1 食源性致病微生物快速檢測技術研究的意義

世界衛生組織在2002年發布的一份報告中表明，全球各國每年發生的食源性疾病達到了數十億例，即使是發達國家也存在至少35%的居民患有或正在患食源性疾病。絕大多數食源性疾病是由細菌所引發的，食源性致病細菌中，沙門菌、志賀菌、單增李斯特菌和變形桿菌等，都屬于較常見的致病菌，這些致病菌往往會引發一些嚴重的重大事件[1-2]。

在2011年，美國就曾經發生了由單增李斯特菌所引發的食源性疾病事件，從7月末到10月初的短短60多天內，50%以上的自治州共出現了110例食源性病例報告，是近20年美國發生的性質最為嚴重的一次疾病發作事件[3-4]。食源性疾病在我國也時有發生，幾乎每年都有食物中毒、食品衛生事件的報道出現，使消費者對食品制造加工、工農業以及消費品等行業的信心受到了嚴重的影響。

雖然當前我國在對食源性致病菌的微生物檢測檢驗方面具有成型的常規檢測檢驗方式，但這些方式方法通常都要在實驗室內進行，檢驗過程包含了對致病菌的采集收集、培養克隆、分離觀測等環節，不但需要耗費一定的物資和人員精力，而且需要較長的時間周期。再加上我國在相關檢測的試劑和器皿等方面無法實現完全配套適應，因此對于公共食品衛生安全事件的快速應急反應處置還無法滿足實際需要。

近幾年以來，越來越多的研究機構和科研人員意識到了食源性致病菌的快速檢測技術研發的重要性。微生物檢測最重要的是準確性，雖然快速檢測法并不能完全確保檢測結果的正確性，但可以通過快速檢測法，辨別出符合檢測標準的樣本，剔除不符合檢測檢驗條件及標準的樣本，從而達到提升檢測效率的目的。得益于科學水平的進步，快速檢驗技術水平也得到了較大的提高。

2 常見檢測方法與技術

2.1 免疫檢測法

2.1.1 酶免疫技術

免疫酶技術是將抗原抗體反應的特異性與酶的高效催化作用有機結合的一種方法。它以酶作為標記物，與相應的抗原或抗體作用后，通過底物的顏色反應進行定性和定量分析，亦可用于組織中抗原或抗體的定位研究。基于酶免疫的檢測方法按照抗體與抗原的反應是否需要對游離的酶生物標記部分的不同結果可以分為兩種不同的類型，即均相法和非均相法，其中最為常見的是非均相法，其中又包括了固相形態免疫法和非固相形態免疫法。

2.1.2 熒光免疫技術

作為免疫檢測技術中最早出現的一種方法，熒光免疫檢測法是以生物學、免疫學、化學以及顯微鏡技術為基礎從而建立起來的。科研人員利用微生物抗原抗體分子和示蹤物質之間的結合，根據抗原抗體的反應特異性來定位組織細胞的內抗物質。這種技術能夠實現對金黃色葡萄球菌、沙門菌以及單增李斯特菌等致病菌的快速檢測。

2.1.3 酶聯熒光技術

當前食源性致病細菌的測試鑒定技術中采用基礎最大的是酶聯熒光檢測鑒定法，這項技術的原理是充分運用已知抗原體的強吸附性，將其與微生物微量檢測反應板中的固體形態載體相連接，固相載體的表面因此產生酶標記物抗原體結合反應，隨后再將液相里的游離成分進行洗滌清除。

2.2 生物分子檢測法

2.2.1 PCR技術

PCR技術即聚合酶鏈式反應技術，其特點是反應速度快，可以在較短的時間內將微量樣本中的特定片段擴大數百萬倍，是當前食品微生物致病菌檢測當中較為常見的一項技術，得到了較為廣泛的應用。雖然該項技術具有簡便、靈活、成本低等特點，但由于市面常見檢測方法與之結合程度不高，因此無法實現精確定量檢測。

2.2.2 基因芯片技術

分子生物學近年來重大進展之一就是基因芯片技術，該技術是采用雜交序列測試法，把一組已知序列核酸的探針之間進行相互雜交，并進行核酸序列的測試定性。由于該技術能夠實現同一時間固定較大數量的核酸探針，因此能夠對檢測樣品的大規模序列進行分析檢驗，大大改善了傳統技術中存在的操作復雜、檢測序列數量少、半手動化、工作效率不高等缺陷，在眾多檢測技術中具有明顯的優勢。

2.3 傳感器檢測法

2.3.1 電化學基因傳感技術

電化學技術近幾年以來在生物核酸傳感方面的實踐與應用上取得了很大的進展，該項技術的核心是利用電化學的核酸探針能夠判斷基因是否存在這一特點，通過檢測器在特定環境與條件中，對探針發出的不同電極、光源信號變換進行監測和識別，并根據結果來判定靶向生物分子是否存在。由于該技術具有明顯的便攜性、靈敏性特點，同時兼具低成本、低功率、低消耗優勢，再加上其對樣品的保護程度高，器具結構微型，在食源性微生物領域的發展前景非常的廣闊[5]。

2.3.2 核酸檢測微流控技術

核酸檢測微流控制技術是將微機械電子系統作為基礎，建立微型閥、微型泵、微型控制器和微型傳感器等單元結構，實現化學分析檢測各環節之間的集約、連續和微型化。該技術最明顯的特點是能把控制多種問題檢測的技術單元集成在小體積靈活控制且具有規模性的平臺中，不但能夠大幅度降低人工操作造成的失誤與差別，還能有效減少檢測時間、壓縮檢測成本，因此該技術在食源性致病源微生物檢測中能夠發揮出靈活、簡單、便捷的特點。

2.4 DNA探針檢測技術

該項技術主要是運用已知序列的DNA片段與未知序列DNA片段之間的雜交，并用特有方式進行探知和標記，具有突出的靈活性和特異性，同時還兼具了化學染色的顯性特點和定位性。在技術運用測試實驗中，能夠對肉毒菌、大腸桿菌、單增李斯特菌和霍亂菌等食源性致病微生菌原體表現出明顯的特異性和敏感性，雖然沙門菌與結腸菌等有交叉反應，但對檢測結果不構成實質影響。

2.5 阻抗檢測法

這是一種利用微生物新陳代謝引發培養基電極特性變動而對檢測樣品微生物的成分與含量進行檢查和測定的方法。檢測樣品中微生物的新陳代謝能夠讓培養基中具有惰性的電分子物質轉換為具有電活性的小分子物質，例如把脂肪、碳水物等轉化為蠟酸鹽、氨基酸等物質。在微生物新陳代謝過程中，培養基里的惰性物質被具有活性的電分子取代，提高了培養基的導電性，根據細胞活性判定其是否具有致病性，檢驗食品中活細胞數量對食品安全檢驗具有明確的實際意義。

2.6 傳感器技術

2.6.1 生物傳感器檢測法

這種檢測法主要是通過生物傳感器實現檢測功能。生物傳感器問世20世紀60年代，在80年代形成一定的規模和固定研究領域，其主要是把固定化的生物敏感材料作為識別元件，再配上恰當的信號傳導裝置，最終構成檢測分析工具。這種工具按照生物元件的不同分為微生物、免疫功能以及酶物質傳感器等類型，優點是靈活程度高、檢測成本低且器具體積小，能夠在腐壞變質或即將腐壞變質的食物中獲得迅速、實時以及多種復雜情況的檢測分析結果。

2.6.2 免疫傳感器檢測法

免疫傳感器檢測法是一種采用新型生物傳感器實現免疫檢測的方法，該傳感器的結構與傳統的生物傳感器具有高度一致性，其主體結構由數據信息處理單元、生物特性感知單元和換能處理單元組成，與傳統技術的區別在于檢測樣本和傳感器識別單元結合之后，產生的物體將生物信號經換能單元變成可被識別的光電信號，尤其是電化學信號的質量好，無論在精確程度、可選范圍、存儲質量以及信號清晰度方面，都具有明顯優勢，但是對比我國2010年出臺的檢測操作規定而言，檢測時長最短需達到一周左右，因此不具備實際操作性。

2.7 蛋白質芯片技術

該技術的原理是，通過蛋白質陣列放大食品中所含蛋白質的生物活性，這一技術主要通過蛋白質芯片實現。蛋白質芯片是由數量巨大的蛋白質、生物探測單元、蛋白質活性檢測試劑按照設計好的序列排列在固定器皿載體中所形成的陣列或微型陣列，能夠提高食品蛋白質活性檢測的數量，增加蛋白質與分子之間的相互作用，實現了生物蛋白質活性測試的高通量及定向測量，在食品安全及生命安全等科學領域發展有重大影響作用。

2.8 納米金檢測技術

納米金技術又可以稱為金染色免疫法，出現于20世紀70年代，其標記物體是納米等級的金質顆粒，納米金指的是直徑在1～100 nm的微小金顆粒，因顆粒的表層具有負極電離子，對靜電有明顯的排斥作用，在液相中可以長久保持穩定形態，形成穩定的膠體。該物質的特性是高電子密度介電性，同時還有催化功能，在與大多數生物因子結合時候保持原有活性，目前已經在免疫細胞學、生物化學、生物標記技術等方面，在食品安全性檢測中發揮了重要作用，是食源性致病菌原體快速檢測及微生物研究中常見的技術，適用于多種類型的檢測，通過在納米金顆粒表面標記上特定的寡核苷酸探針以及對納米金顆粒表面特性的處理，開發出了一系列新的生物檢測系統，為分子級別領域實現快捷檢測致病微生物提供了技術基礎，甚至能夠檢測出致病源菌的耐藥性變異情況，對大腸埃希氏菌、沙門菌、志賀氏菌、霍亂弧菌和副溶血弧菌等具有高靈敏度和特異性[6]。

3 研究現狀

我國南京工業大學科研團隊于2018年全球首次開發出了基于熒光素酶的系列食源性致病菌快速檢測系統，實現了對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌O157、奇異變形桿菌及產氣腸桿菌肺炎克雷伯氏桿菌的單獨和混合檢測，最低檢測限達10 CFU，與傳統食品菌落檢測儀和熒光定量PCR法相比，該系統具有更高的特異性，可以將檢測時間縮短至2～3 h，且設備、試劑成本相對較低，與現有系列食源性致病菌檢測系統相比，具有極大的競爭優勢。細菌的識別檢測在疾病防控、臨床診斷以及食品衛生安全等領域具有重要研究價值和實用意義，建立快速靈敏的細菌檢測新技術和新方法已經成為國內外研究熱點。這款食源性致病菌快速檢測系統，體現了快速靈敏的細菌檢測技術，為實現細菌檢測微型化、自動化和實時現場檢測提供新途徑和廣闊前景，對疾病控防、臨床診斷以及食品衛生安全等領域具有重要研究價值和實用意義[7]。

2019年初，中國農業大學科研團隊利用微流控技術實現食源性致病菌的快速、靈敏檢測。微流控技術近年來發展迅速，芯片集成的單元部件越來越多，集成規模也越來越大，同時微流控芯片可以大量平行處理樣本，具有高通量、分析速度快、物耗低、污染小的特點，使之為材料學、化學、生命科學和生物醫學等領域的基礎與應用提供了一個有力的平臺。這種新型的食源性致病菌檢測技術，先利用同軸通道和二氧化硅磁珠進行DNA提取和富集，再利用融智生物微流控核酸定量分析平臺QuanPLEX和微流控芯片進行DNA擴增和檢測，可在2 h內檢出低至12 CFU·mL-1的大腸桿菌O157∶H7，實現了食源性致病菌的快速、靈敏檢測。傳統檢測技術對PCR技術的依賴程度較高，在市面中常見的常規PCR、免疫PCR、微控PCR、實時PCR及多重PCR等技術中，微控PCR以操作自動化、檢測成本低、檢測時間快及交叉污染少等特性受到越來越多的關注，因其快捷、高效、靈活等優勢，廣泛應用在食源性微生物的快速檢測領域，但是從復雜食品樣本中提取核酸的技術研究卻鮮有人關注。這些方法通常操作較復雜、勞動強度較大、耗時較長且存在重現性和毒性試劑等局限性。更重要的是，它們不適用于從大量樣本中提取少量靶向DNA。

中國農業大學研究中所用的微流控核酸定量分析平臺是融智生物QuanPLEX食品安全微生物快速檢測系統。QuanPLEX是一款符合國標的食品微生物快檢系統，可同時檢測32個指標；檢測速度快，比傳統qPCR檢測速度提高一倍以上；安全性好，封閉式芯片可避免氣溶膠污染；極簡前處理，一鍵式操作軟件，操作簡便。在檢測大體積樣品中低濃度大腸桿菌O157∶H7中表現出了巨大潛力，將傳統的細菌分子生物學檢測技術的靈敏度提高了近百倍，有望實現食源性致病菌的現場、快速、多目標檢測，切實保障食品安全[8]。

4 展望

目前，傳統的食源性病原菌的檢測、鑒定仍停留在分離培養、形態觀察、生化鑒定和血清學分型水平。這些方法操作煩瑣、需要時間較長、準備和收尾工作繁重，檢測周期較長，而且無法對難以培養的病原菌進行檢測，因此病原微生物的檢測結果往往存在不同程度的滯后性。這不僅不利于食品安全管理體系及時驗證控制措施實施效果，而且不利于對潛在不安全產品迅速采取糾正和糾正措施。對食源性致病菌進行準確、靈敏、省時、省力和省成本的快速檢驗方法已經成為保證食品安全的迫切需求[9]。

隨著科學技術的發展和人們對食品安全的重視程度的不斷增強，食品中致病性病原微生物的快速檢測將在食品工業原料質量估測、加工工藝評估、成品質量檢測、產品貨架期預測等方面得到越來越廣泛的應用，在食品安全管理體系的建立和實施中發揮越來越重要的作用。這些快速檢測技術的推廣應用，不僅是對傳統的食品安全檢測技術的一個改進和提高，也使食品質量安全有了進一步的保證，從而推動食品工業更加健康、快速向前發展，改變人類的生活質量，滿足人民提高健康水平的需要。我國采用的大多數是國外的快速檢測技術，檢測成本高，缺乏相應國家標準。在以后的工作中，應采取多種方法，引進、消化國外的先進技術，生產出我國自己的快速檢測產品。同時積極組織研究所、大專院校和企業的專家建立國家標準和規范，推動我國快速檢測技術的發展[10]。