虎杖總蒽醌對肺間質纖維化大鼠上皮間質轉化過程中TGFβ1-smad 信號通路的影響

黃 鶯，徐 芳

（武漢市第一醫院呼吸內科，湖北武漢 430022）

肺間質纖維化是由多種原因引起的肺間質炎癥性疾病，病變主要累及肺間質［1］，也可累及肺泡上皮細胞及肺血管，是許多間質性肺疾病的最終病理表現，也是目前肺纖維化的一個主要發病特點及病變部位。其發病機制尚未確定，研究表明，可能與環境、粉塵接觸、吸煙、年齡及服用某些藥物等有關［2-3］。近年來，上皮-間質轉化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）已被眾多研究者認為是成纖維細胞的重要來源［4］，而與EMT 的發生密切相關的TGF-β1-Samd 信號通路已成為目前研究的重要聚點。研究證實Samd3 的缺失或減少可使TGF-β1 出現功能性減弱，對纖維化的發生有很好的拮抗作用［5］。有研究者發現虎杖流浸膏可有效抑制肺纖維大鼠肺組織中TGF-β1的表達強度，但具體作用蛋白尚未定論，本研究前期發現虎杖水提物對A549 細胞TGF-β1-Samd 信號通路下游部分因子有很好的調控作用，此次研究選取虎杖中活性成分總蒽醌為研究對象，利用中醫藥靶點豐富、副作用少、適用于臨床的優勢分析探討對肺間質纖維化大鼠模型中TGFβ1-Samd 信號的干預作用［6-7］，并用Smad3 siRNA 阻斷TGFβ1-Smad 信號通路及Smad3 蛋白抑制劑進行干預，探索Taopc 治療肺纖維化的作用機制，為肺纖維化的防治提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF 級雄性SD 大鼠60 只，購自濟南朋悅實驗大鼠繁育有限公司，動物生產許可證號SCXK（魯）20140007。博來霉素（哈爾濱博萊制藥有限公司，批號20170411）；Smad3 抑制劑（杭州聯科生物技術股份有限公司，批號20170516）；虎杖總蒽醌（寶雞市辰光生物科技有限公司，質量分數47.82%）；TGF-β、Smad3、a-SMA、CTGF、E-CAD 基因引物、Smad3 siRNA 質粒構建均由上海生工生物工程有限公司合成；CDNA 試劑盒、逆轉錄試劑盒、RT-PCR 試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）；HYP、TNF-α、VEGF、MMP-2、間質膠原蛋白Ⅰ、間質膠原蛋白Ⅲ試劑盒（蘇州卡爾文生物科技有限公司，批號E20170721A、E20170727A、E20170618A、E20170604A、E201700803A、E20170620A）；CS-6400 全自動生化分析儀（迪瑞醫療科技股份有限公司）。

1.2 分組與給藥 參考文獻［8-9］報道的方法。取大鼠50 只，適應性喂養1 周后隨機分為空白組、博來霉素組、虎杖總蒽醌組、Smad3 siRNA 基因沉默大鼠+虎杖總蒽醌組、Smad3 抑制劑+虎杖總蒽醌組，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，頸部切開皮膚脫毛并剝離出氣管，注射BLM 10 mg／kg，空白組給予同等劑量生理鹽水。造模后次日，虎杖總蒽醌組給予虎杖總蒽醌（400 mg／kg）灌胃，Smad3 siRNA+虎杖總蒽醌組給予虎杖總蒽醌灌胃并尾靜脈注射Smad3 siRNA 質粒（3 mL／kg），Smad3 抑制劑+虎杖總蒽醌組給予Taopc 灌胃于腹腔注射SIS3（2 mg／kg），空白組灌胃給予同等劑量生理鹽水，連續4 周。取右肺，RT-PCR 檢測肺組織勻漿中上皮細胞標志物（E-cad）、間皮細胞標志物（α-SMA）及信號通路相關分子Smad3、TGFβ1、CTGF的mRNA 的蛋白表達變化。取左肺組織勻漿后離心，堿裂解法檢測肺組織HYP 水平，摘眼球取血后離心，酶聯免疫吸附法檢測血清TNF-α、VEGF、MMP-2、間質膠原蛋白Ⅰ、間質膠原蛋白Ⅲ的水平。

1.3 指標檢測

1.3.1 血清指標 于96 孔板上設置標準孔，加入標準液，除標準孔外依次加入待檢標本、稀釋液封板，室溫或37 ℃下孵育1 h，棄去液體，于洗板機上清洗3 次，加入封閉緩沖液室溫或孵育30 min 避光，隨后加入底物顯色孵育30 min后加入終止液，450 nm 波長下檢測吸光度值。

1.3.2 RT-PCR Real-time PCR 法檢測TGF-β1、Smad3、α-SMA、CTGF、E-cadmRNA 表達。取肺組織適量，研磨并加入1 mL Trizol 混合均勻，提取上層RNA 溶解物后測濃度。取總RNA 2μg 進行逆轉錄，反應條件為37 ℃反轉錄15 min，85 ℃，5 s，合成cDNA，PCR 引物序列見表1。PCR 擴增反應條件為95 ℃預變性10 min，95 ℃，15 s，60 ℃退火延伸45 s 采集信號，重復40 個循環。每個組別做3 次定量檢測，采用公式Q＝2-ΔΔCt，GAPDH 為內參，計算mRNA 相對表達量。

表1 引物序列

1.4 統計學分析 通過SPSS 17.0 軟件進行處理，計量資料以（）表示，組間比較根據方差是否齊性，采用LSD法或Games-Howell 法；等級資料組間比較采用Ridit 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠肺組織E-cad、TGF-β1、Smad3、a-SMA、CTGFmRNA 水平 與空白組比較，博來霉素組大鼠肺組織E-cad水平降低（P＜0.05），TGF-β1、Smad3、a-SMA、CTGF 水平升高（P＜0.05）；與博來霉素組比較，虎杖總蒽醌組大鼠肺組織E-cad 水平升高（P＜0.05），TGF-β1、Smad3、a-SMA、CTGF 水平降低（P＜0.05）；與虎杖總蒽醌組比較，SiRNA+虎杖總蒽醌組、Smad3 抑制劑+虎杖總蒽醌組大鼠肺組織E-cad 水平降低（P＜0.05），TGF-β1、Smad3、a-SMA、CTGF 水平升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠肺組織E-cad、 TGF-β1、 Smad3、 a-SMA、 CTGF mRNA 水平比較（， n＝10）

表2 各組大鼠肺組織E-cad、 TGF-β1、 Smad3、 a-SMA、 CTGF mRNA 水平比較（， n＝10）

注：與博來霉素組比較，?P＜0. 05；與空白組比較，△P＜0. 05；與虎杖總蒽醌組比較，#P＜0.05。

2.2 大鼠血清TNF-α、VEGF、MMP-2 水平 博來霉素組大鼠血清TNF-α、VEGF、MMP-2 水平高于空白組（P＜0.05）；與博來霉素組比較，虎杖總蒽醌組大鼠血清TNFα、VEGF、MMP-2 水平降低（P＜0.05）；與虎杖總蒽醌組比較，SiRNA+虎杖總蒽醌組、Smad3 抑制劑+虎杖總蒽醌組大鼠血清TNF-α、VEGF、MMP-2 水平升高（P＜0.05）。見表3。

2.3 各組大鼠肺組織HYP 及血清CollagenⅠ、CollagenⅢ水平 博來霉素組大鼠肺組織HYP 水平及血清CollagenⅠ、CollagenⅢ水平高于空白組（P＜0.05）；與博來霉素組比較，虎杖總蒽醌組大鼠肺組織HYP 水平及血清CollagenⅠ、CollagenⅢ水平降低（P＜0.05）；與虎杖總蒽醌組比較，SiRNA+虎杖總蒽醌組、Smad3 抑制劑+虎杖總蒽醌組大鼠肺組織HYP 水平及血清CollagenⅠ、CollagenⅢ水平升高（P＜0.05）。見表4。

表3 各組大鼠血清TNF-α、VEGF、MMP-2 水平比較（， n＝10）

表3 各組大鼠血清TNF-α、VEGF、MMP-2 水平比較（， n＝10）

注：與博來霉素組比較，?P＜0. 05；與空白組比較，△P＜0. 05；與虎杖總蒽醌組比較，#P＜0.05。

表4 各組大鼠肺組織HYP 及血清CollagenⅠ、CollagenⅢ水平比較（， n＝10）

表4 各組大鼠肺組織HYP 及血清CollagenⅠ、CollagenⅢ水平比較（， n＝10）

注：與博來霉素組比較，?P＜0. 05；與空白組比較，△P＜0. 05；與虎杖總蒽醌組比較，#P＜0.05。

3 討論

上皮-間質轉化（EMT）是具有極性的上皮細胞轉化為具有運動能力的間質細胞過程，在肺間質纖維化過程中占據重要地位，也是肺纖維化疾病發展的最終方向［10］。研究發現，細胞外信號可通過作用多條信號通路途徑導致肺纖維化的產生，進而產生肺間質纖維化，而與EMT 發生相關的信號通路主要包括TGF-β 信號通路、PI3K-AKT-mTOR 信號通路、Wnt 信號通路、MAPK 信號通路及NF-κB 信號通路等，以上通路中TGF-β 信號通路與EMT 的發生關系最為密切，可誘導多種上皮細胞EMT，被認為是各器官纖維化發生的總開關（包括肺纖維化）［11］。近年來，關于TGF-β信號通路在肺纖維化疾病中的研究多集中于TGFβ1-smad信號通路的研究，目前眾多被研究藥物多通過調控TGFβ1／Smad 直接或間接抑制成纖維細胞的增殖，減輕肺組織ECM 的生成和沉積，達到治療肺纖維化疾病的目的［12］。TGFβ1 是TGF-β 家族中水平最豐富的一種調控因子，生物作用廣泛，具有促進膠原分泌，促進纖維化細胞增殖，增加蛋白酶抑制物水平，增加ECM 沉積等作用，在肺纖維化過程中具有重要作用［5］。TGF-β 通過與受體結合將信號傳導至下游Smads 家族，具體傳遞過程為TGF-β1 首先與TGF-βRⅡ二聚體結合，形成復合物，再結合TGF-βRⅠ二聚體形成異四倍體，使TGF-βRⅠ的GS 區被磷酸化激活，而TGF-βRⅠ磷酸化激活Smad2 和Smad3，磷酸化的Smad2或Smad3 結合Smad4 形成低聚體復合物，轉移到細胞核內參與調節目的基因的轉錄反應，導致細胞內外纖維發生蛋白的表達增加，加速纖維化的進展。因此，對TGF-β1／Smads 信號通路的研究，對于預防及治療肺纖維化性疾病具有重要意義。

肺纖維化的發病過程中，在各種各種損傷因素的作用下，肺泡上皮細胞發生EMT 并使標志性蛋白ɑ-SMA 表達上調，上皮細胞標志物E-cad 逐漸丟失，細胞外基質大量生成和沉積，導致肺間質纖維化發生［13］。此外，TGF-β1／Smad 信號通路被激活，TGF-β1 信號下傳首先接觸Smad 蛋白，建立起細胞質及細胞核間的信號傳導通路，進而使TGF-β 下游效應因子CTGF、MMP-2、VEGF 表達上調加重纖維化程度［14］。CollagenⅠ、CollagenⅢ作為細胞外基質（ECM）主要成分，是由Fb 及其轉型后的MFb 合成和分泌，ɑ-SMA 是Fb 轉型為MFb 的標志，肺纖維化疾病產生時，TGF-β1／Smads 信號通路被激活，ɑ-SMA 表達上調，間接使CollagenⅠ、CollagenⅢ合成增多，增加ECM，加重纖維化程度［15］。HYP 主要存在于膠原蛋白內，隨著膠原蛋白生成的增多而增高，故可作為反映膠原水平的間接指標，常被用于評價肺纖維化［16］。TNF-α 可促進肺膠原纖維的過度增生，并增加細胞外基質的分泌，造成肺纖維化的病理改變［17］。

本研究采用氣管注入博來霉素（BLM，10 mg／kg）建立肺纖維化大鼠模型，通過Smad3 基因沉默及運用Smad蛋白抑制劑進行干預，觀察虎杖總蒽醌對肺間質纖維化大鼠上皮間質轉化過程中TGFβ1-smad 信號通路的影響［18］。研究發現，虎杖總蒽醌可升高大鼠肺組織中E-cad 水平，降低TGF-β、Smad3、ɑ-SMA、CTGF 水平，而SiRNA+虎杖總蒽醌組及Smad3 抑制劑+虎杖總蒽醌組大鼠肺組織中Ecad 水平降低，TGF-β、Smad3、ɑ-SMA、CTGF 水平升高，與虎杖總蒽醌組形成相反趨勢；肺組織及血清指標檢測可知，虎杖總蒽醌組肺組織HYP、血清CollagenⅠ、CollagenⅢ、TNF-ɑ、VEGF、MMP-2 水平均有所降低，SiRNA+虎杖總蒽醌組與Smad3 抑制劑+虎杖總蒽醌組大鼠肺組織HYP、血清CollagenⅠ、CollagenⅢ、血清TNF-ɑ、VEGF、MMP-2水平呈現升高趨勢，與虎杖總蒽醌組形成相反趨勢。

此次研究可知，虎杖總蒽醌可能通過阻斷Smad3-TGFβ1 信號傳導通路，減少TGF-β 的表達，阻斷該信號通路減少TGF-β 下游效應因子表達，并降低肺組織HYP 及血清TNF-ɑ 炎癥因子作用，進一步抑制上皮細胞向成纖維細胞轉化，從而延緩肺纖維化的進展。此外，本研究選取中藥虎杖為研究對象，利用中醫藥靶點豐富、副作用少、適用于臨床的顯著優勢，為臨床攻克肺間質纖維化疾病提供了一定的實驗支撐及用藥指導。但本研究僅選取TGFβ1-smad信號通路進行研究，與肺間質纖維化相關的其他通路如PI3K-AKT-mTOR 信號通路、Wnt 信號通路、MAPK 信號通路及NF-κB 信號通路等方面并未進行相關研究，此外，本次研究數據方面稍顯不足，后續將進一步擴大研究范圍，對中藥虎杖在肺間質纖維化方面進行更加深入研究，為臨床攻克肺間質纖維化疾病提供一定實驗支撐及用藥指導。