仿生修飾結合三維打印技術構建的膠原-聚己內酯支架可促進兔臨界骨缺損修復

盧俊欽 楊鑫 李軍 孫堅

骨是人體最易損傷的組織之一，因感染、創傷、腫瘤切除等導致的大塊骨缺損的治療仍是現代醫學面臨的難題［1］。自體骨移植作為治療骨缺損的金標準，從19 世紀初至今一直被廣泛運用于臨床，然而自體骨移植是“以創治創”的模式，存在供區骨量不足和供區功能受損等并發癥［2-3］。基于生物材料開發的骨移植替代物，克服了自體骨移植的缺點，有望廣泛應用于骨缺損的治療［4-5］。

目前，生物陶瓷、天然及人工聚合物等作為骨替代材料被運用于骨缺損治療的研究或臨床［4，6］。磷酸鈣類陶瓷材料，如羥基磷灰石、β 磷酸三鈣等，因具有與骨組織無機組分相近的特點和良好的生物相容性而被廣泛運用，但其易脆、抗疲勞強度低、機械性能差，大多用于腔隙性骨缺損修復［4，7-8］。膠原（Collagen，Col）是一種天然聚合物，是機體組織中最主要的有機成分。基于膠原制備的生物材料，具有良好的生物可降解性和生物相容性，但是膠原支架材料機械性能較弱，目前大多用于皮膚、角膜以及腔隙性骨缺損等部位的修復。合成類聚合物，如聚己內酯（PCL）、聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）等，具有可控的機械性能和可生物降解的優勢，已被廣泛運用于骨組織工程材料的實驗研究中［9-13］。目前，基于熔融成型三維打印技術制備的PCL 三維支架已獲美國食品藥品監督管理局（FDA）批準，可運用于顱頜面部骨缺損修復治療［4］。前期，本課題組利用三維打印技術（Three dimensional printing）制備出三維多孔PCL 支架，該PCL 支架具有可控的孔徑結構和完全空隙連通率，并可根據需要制備出個體化骨替代移植物［14］。然而，單一PCL 支架具有較強的表面疏水性能和生物惰性，導致體外細胞黏附能力差，植入體內后存在纖維組織包繞和組織整合不良等問題［12，15］。

為了克服單一材料的缺點，最大限度地發揮各類材料的優勢，本研究擬構建一種可降解仿生復合材料Col-PCL。利用三維打印技術制備出基于骨缺損的骨充填PCL 支架材料，在三維多孔PCL 支架表面及內部，利用膠原模擬自然骨組織的細胞外基質（ECM）進行仿生修飾，以提高支架材料的生物活性；而PCL 則作為“骨架”為多孔膠原基質提供力學支撐。通過體外及體內試驗驗證該支架材料的生物活性及成骨活性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

12 只6 月齡雄性新西蘭大白兔、6 只28 天齡胎兔均購自上海甲干生物科技有限公司。本研究中的相關動物實驗得到上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院倫理委員會批準（SH9H-2019-A514-1）。

PCL（相對分子質量850 000，深圳光華偉業股份有限公司），豬皮膠原（四川銘讓生物科技有限公司），EDC（Sigma 公司，美國），CCK-8（日本株式會社同仁化學研究所），細胞LIVE／DEAD 染色劑（Thermo Fisher 公司，美國）。

三維打印熔融成型機（HTS MAM-ⅡFree From Fabrication，富奇凡機電科技有限公司），場發射掃描電子顯微鏡（S-4800，Hitachi 公司，日本），萬能測試機（Instron 5542，美國），倒置相差顯微鏡（萊卡，德國），激光共聚焦顯微鏡（萊卡，德國），Micro-CT（GE eXplore Locus SP Micro-CT，美國）。

1.2 三維打印PCL 支架材料

將PCL 原料裝入三維打印熔融成型機的熔化器中，加熱至120 ℃，維持溫度，使PCL 融化成半流態，在計算機控制下按stl.文件模塊的形狀，由直徑為500 μm 噴嘴沿X、Y軸在特定的位置擠出，降溫至常態后凝固，然后沿Z軸上升一個高度再重復X、Y軸的運動，噴嘴中再擠出半流態PCL，降溫凝固時與下一層緊密粘結，如此一層層堆積制作支架，制備出骨缺損植入PCL 支架。

1.3 PCL 支架材料的仿生修飾

將三維打印的PCL 支架材料置入5 mol／L 的NaOH 溶液中2 h，進行表面活化。取出后以雙蒸水清洗至pH＝7.4，無菌櫥晾干備用。配制10 mg／mL的豬皮膠原溶液。將表面活化后干燥的PCL 支架浸入10 mg／mL 膠原溶液中，真空抽吸30 min，去除氣泡，緩慢釋放至正常大氣壓。PCL 支架完全浸沒在膠原凝膠中，使膠原凝膠完全充填在PCL 支架孔徑內部。無菌鑷子夾持，將膠原充填后的PCL 支架取出，輕放于無菌培養皿中，-20 ℃冷凍24 h，-50 ℃冷凍干燥48 h，得到凍干的Col-PCL 支架。將上述Col-PCL 支架置入50 mmol／L 的EDC 交聯劑中常溫交聯24 h，無菌雙蒸水超聲振蕩清洗3 次，冷凍干燥，獲得本實驗所需Col-PCL 支架材料［16］。

1.4 Col-PCL 支架材料表征

將材料切成5 mm×5 mm×3 mm 大小，75%乙醇超聲振蕩清洗3 遍，雙蒸水超聲振蕩清洗3 遍，冷凍干燥24 h，干燥無菌條件下保存。進行場發射掃描電子顯微鏡（FESEM）觀測前，在10 mA 電流下噴金20 s，在10 kV 電壓下對PCL 三維支架進行三維結構的觀測，對PCL 和Col-PCL 支架材料的孔徑進行測量，依據表觀密度法測量PCL 和Col-PCL 支架的孔隙率［17］。

1.5 機械性能檢測

支架材料的力學性能采用抗壓強度和抗壓模量來進行檢測。實驗在萬能測試機Instron 5542 上進行，支架壓縮實驗樣品為圓盤型，直徑10 mm，高為3 mm，實驗時沿支架材料的Z軸施壓，壓縮速率為1 mm／min，最大壓力為500 N，當形變量達到80%時停止壓縮，最后樣品壓縮模量經由壓縮應力-應變曲線的線性區斜率獲得，每組有5 個實驗樣品，實驗結果取平均值［18］。

1.6 體外細胞活性檢測

取28 天齡幼兔的雙側股骨，剪斷干垢端，用生理鹽水沖洗骨髓腔內細胞至培養皿，靜置培養4 d，去掉上清及懸浮細胞，可見貼壁生長的細胞，為兔骨髓間充質干細胞（Rabbit bone marrow stromal cells，r-BMSCs），繼續細胞培養，至細胞生長至80%后傳代，取第三代r-BMSCs 用于后續實驗。

將材料切成5 mm×5 mm×3 mm 大小用于檢測體外細胞活性，消毒后置于24 孔板中，將第三代r-BMSCs 懸液以3×104個（25 μL）的密度接種到支架材料上，孵育1 h 后，將同樣的細胞懸液以相同的密度接種于支架的另一面，再次孵育1 h，加入1 mL 培養基培養。分別在接種1、3、7 d 將支架轉入96 孔板中，加入CCK-8 工作液110 μL（100 μL D10 加入10 μL CCK-8 儲存液）孵育2 h，酶標儀在450 nm波長下檢測光密度，以評價細胞在支架材料上的增殖活性［19］。每天在倒置相差顯微鏡下觀察接種細胞后的支架材料。于細胞接種后7 d 取出支架材料，PBS 清洗3 遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3 遍，細胞LIVE／DEAD 染色劑染色10 min，PBS 清洗3 遍后，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞形貌及細胞活性。

1.7 體內骨缺損治療研究

12 只6 月齡雄性新西蘭大白，隨機分成2 組：PCL 組（n＝6）和Col-PCL 組（n＝6）。麻醉后，消毒左前肢，以尺橈骨中點為中心做縱行切口，長約20 mm，逐層切開皮膚、筋膜及肌層，顯露左側尺橈骨中段，牙鉆制備出15 mm 橈骨中段缺損。Col-PCL組植入Col-PCL 支架材料，PCL 組植入PCL 支架材料。手術結束后，生理鹽水沖洗，止血后對位分層縫合，術后給予抗生素肌內注射3 d。術后12 周過量麻醉處死動物，取出術側橈骨及尺骨，4%甲醛固定1 周。將目標骨組織修整后進行Micro-CT 掃描，用Micro-CT 自帶軟件進行圖像數據采集及三維重建，計算新生成骨量；同時進行HE 和Manson 染色，顯微鏡下觀察。

1.8 統計學分析

所有數據均用ˉx±s表示。數據組間差異統計采用SPSS 18.0 的單因素方差分析，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 支架材料表征

如圖1 所示，PCL 支架材料垂直孔洞呈三角形，孔隙相互連通，堿處理法表面活化后，PCL 支架的大體形態和結構并未引起任何改變，堿活化處理使PCL 支架表面變得更加粗糙。膠原仿生修飾后，多孔膠原呈海綿狀均勻充填在PCL 支架的孔洞之間，三維打印PCL 的大孔結構消失。場發射掃描電子顯微鏡（FESEM）觀察顯示，PCL 支架表面可見堿腐蝕的粗糙表面，但支架孔徑大小均勻，孔徑大小約（405±8.4）μm，膠原修飾活化后，多孔膠原支架填充到PCL 大孔中間，膠原具有多孔結構，孔徑大小均勻，多孔的膠原呈網狀充填在PCL 支架水平孔洞內部并包繞支架的梁，形成大小約100 μm 的孔徑。表觀密度法測量顯示，PCL 支架孔隙率為67.4%±1.8%，Col-PCL 孔隙率為65.9%±1.5%，修飾后的支架空隙率有所下降，但差異不具有統計學意義（P＞0.05）。機械性能測試表明，PCL、Col-PCL 分別具有（42.40±4.92）MPa、（53.42 ±6.22）MPa 的抗壓模量，差異顯著（P＜0.05）。

2.2 評估細胞黏附和增殖

圖1 PCL、Col-PCL 支架大體觀察及場發射掃描電子顯微鏡觀察Fig.1 General observation and FESEM observation of PCL and Col-PCL scaffolds

r-BMSCs 接種到支架材料上7 d，倒置相差顯微鏡觀察發現，PCL 支架及Col-PCL 支架材料均有細胞增殖和生長。利用LIVE／DEAD 染色劑對支架材料上的細胞進行死活染色，共聚焦顯微鏡觀察發現，接種后7 d，在PCL 及復合支架材料Col-PCL 上均有活細胞生長，細胞呈圓形或卵圓形，細胞分布均勻，細胞主要分布在多孔膠原網絡表面；與PCL 組相比較，Col-PCL 支架組展現出了更多的初始細胞量，這與Col-PCL 具有較高的接種效率有關。細胞增殖實驗結果表明，接種后1、3、7 d，復合支架材料組細胞數量明顯較PCL 支架組多，且隨時間延長對比越來越明顯，說明細胞在Col-PCL 支架材料上增殖活性更高，這與Col-PCL 支架材料能提供更多的增殖空間有關（圖2）。

2.3 兔橈骨臨界骨缺損修復

如圖3 所示，順利制備15 mm 新西蘭大白兔橈骨中段缺損，并植入對應支架材料（PCL、Col-PCL），術后所有動物均未出現術區感染等癥狀。

圖4 表明，利用Micro-CT 對新生骨量進行分析評估發現，PCL 組沒有明顯的新生骨組織形成，只有在骨斷端兩端有散在少量骨組織新生和長入；Col-PCL組的三維重建圖像中，可見新生骨組織實現了骨斷端的連接，同時在骨缺損區有皮質骨形成，將支架材料包繞骨組織內部。對新生骨量進行統計分析發現，Col-PCL 組新生骨組織體積明顯較PCL組多，Col-PCL 有（95.49±11.13）mm3的新生骨量，PCL 只有（30.78 ± 8.94）mm3的新生骨量，差異顯著（P＜0.05），新生骨量／組織缺損（BV／TV）也差異顯著（P＜0.05）。

圖2 體外評估細胞在支架材料上的黏附和增殖Fig.2 In vitro evaluation of the cell adhesion and cell proliferation on the scaffolds

圖3 兔橈骨臨界骨缺損修復實驗Fig.3 The critical bone defect experiment of rabbit radius

圖4 Micro-CT 評價支架材料修復兔橈骨臨界骨缺損Fig.4 Micro-CT evaluation of the bone defect treatment in the critical bone defect experiment of rabbit radius

組織學分析時，采用平行于橈骨長軸的縱向切片方式。HE 染色發現，PCL 組骨缺損區被染成淡紅色的疏松纖維結締組織充填占據，同時纖維組織緊緊包裹覆蓋在PCL 橫梁周圍；這一結果在Manson 染色中同樣被證實，淡藍色的纖維組織包繞支架周圍，在支架與骨斷面的連接處，形成致密的纖維界面。在Col-PCL 組中，骨缺損區主要由新生骨組織充填，Masson 染色發現骨缺損區的新生骨組織中有成熟（暗紅色）的和不成熟（淺藍色）的骨組織，新生的骨組織直接與支架材料結合，通過支架材料與骨斷端處的原始骨組織相連接；同時在Col-PCL 組中，新骨生成的中央可見到骨髓樣組織形成，說明新生骨組織在逐漸成熟并與正常骨組織有同樣的結構和功能（圖5）。

圖5 組織學評估Fig.5 Histological evaluation

3 討論

骨組織工程支架材料不僅應具有多孔結構和優良的生物相容性，同時還應具有局部骨傳導性及合適的機械強度。適當機械穩定性是指支架材料應具有與自體骨相近或相匹配的機械強度，以抵抗機體壓力、穩定局部成骨微環境，直到新生骨組織具有力學支撐功能［20］。之前的研究證實，機械強度更高的材料可促進間充質干細胞向成骨細胞方向分化，促進軟骨內成骨［21-22］。該結果提示，開發一種具有與自體骨機械性能相近的支架材料將會有利于骨組織的再生。

PCL 具有熔點低（63 ℃）、易于加工等特點，已被廣泛運用于制備組織工程支架材料［11，23-24］。本研究利用三維打印制備多孔PCL 作為支撐骨架材料，以承載機體重力和抵抗局部組織的收縮力。本研究中，機械性能測試表明，PCL、Col-PCL 分別具有（42.40±4.92）MPa 和（53.42±6.22）MPa 的抗壓模量，在一定程度上能滿足硬組織修復的力學支持需要（10～1 500 MPa）［25］。兔橈骨臨界節段性骨缺損植入實驗結果也表明，三維打印的PCL 支架材料及Col-PCL 支架可以承載局部骨組織再生所需的力學支撐。

除了考慮機械性能以外，支架材料生物學性能也非常重要。之前的研究表明，單獨使用人工合成聚合物支架材料可導致纖維組織的包裹，從而削弱組織再生能力導致組織再生不足［4］。堿表面處理法可提高聚合物支架表面粗糙度，減少成纖維細胞黏附的密度，而成纖維細胞是合成膠原和形成纖維包裹的最主要細胞，與之前研究結果一致［4，26-27］。本實驗中，堿活化處理后PCL 支架表面變得更加粗糙，使得PCL 支架材料具有較好的親水性能和吸水性能，更有利于細胞黏附、增殖以及營養物質轉運［18］。然而體內試驗證實，堿處理表面活化后的PCL 支架仍有大量的纖維組織浸潤和包裹，基本沒有新骨形成，不能實現臨界骨缺損的修復，這說明單純靠堿處理表面活化并不足以改善和提高PCL 的生物活性。

為了提高PCL 支架生物活性，有研究嘗試在PCL 支架中混入磷酸鈣類生物陶瓷顆粒，但存在材料混合不均、成型后大部分無機材料顆粒被聚合物包裹而不能顯露于材料表面等缺點［28-30］。亦有研究嘗試利用靜電絲仿、熔融成型法及表面Col 涂層等方法制作Col-PCL 復合支架，以提高PCL 支架活性［11-12，31］。體外研究表明，這些方法均可一定程度上提高PCL 的生物活性，但都缺乏進一步的體內試驗研究結果。本研究中，為了最大限度復合膠原從而最大程度提高PCL 活性，我們設計了大孔徑的PCL 支架材料，這一支架材料具有多孔結構和完全的孔隙連通率。經過膠原三維活化后的PCL 支架材料提高了細胞接種效率，細胞均勻分布于支架表面。這是因為膠原修飾后的支架具有更大的表面積，提供了更多的細胞黏附位點，可富集更多的內源性細胞，從而促進缺損區域的骨修復［31］。另外，三維網狀膠原支架作為空間填充材料，均勻分布在PCL 表面和支架孔隙中，起到了臨時屏障和空間占據作用，阻止早期纖維組織的浸潤，降解后可為新骨形成提供空間，在三維空間上起到膜引導骨再生的作用。

支架材料植入兔橈骨臨界骨缺損12 周后，能實現兔橈骨1.5 cm 臨界骨組織缺損的修復。相對于PCL組，Col-PCL 組具有約3.1 倍［（95.49±11.13）mm3vs.（30.78±8.94）mm3］的新骨生成能力。這一結果表明，Col-PCL較PCL 支架具有較好的骨形成能力，一方面與支架材料具有較好的細胞黏附能力有關，另一方面仿生礦化的膠原基質分布于大孔PCL 之間，提供了一個三維屏障，起到臨時充填和阻隔作用，以防止支架植入早期纖維組織的長入，為新骨的長入提供了空間，起到了膜引導骨組織再生的作用［32-33］。所有這些因素都促進了支架材料的骨修復能力和骨整合能力，使得Col-PCL 支架材料在12周內實現對兔橈骨臨界骨缺損的修復。

4 結論

本研究利用仿生功能化支架材料Col-PCL 對兔橈骨臨界骨缺損進行修復，以驗證支架材料的骨修復能力。支架材料植入兔橈骨臨界骨缺損12 周后，經影像學和組織學分析發現，Col-PCL 支架具有良好的骨誘導性和骨傳導性以及極好的骨整合能力，能在12 周內實現對兔橈骨臨界骨缺損的修復，該支架作為一種骨缺損治療的骨移植替代品，具有一定的研究和應用前景。