軟骨脫細胞基質仿生支架的制備及其對骨髓基質干細胞成軟骨分化的影響

張沛靈 慈政 賈立濤 劉豫 曹誼林 周廣東

軟骨缺損是臨床常見的疾病之一。由于缺乏血管與神經，軟骨組織一旦受損便很難進行自我修復［1-2］。目前的治療手段主要包括軟骨成形術、自體軟骨細胞移植、自體軟骨組織移植等，但均有其局限性［3］。組織工程技術為臨床軟骨修復提供了新的途徑和更廣闊的應用前景［4-5］。組織工程研究主要包括三個方面：種子細胞、支架材料和生長因子。其中，數量充足的種子細胞是組織再生的物質基礎，支架材料可以提供適宜的生理微環境，對體外構建軟骨具有關鍵作用。

近年來，來源于各種組織和器官的脫細胞基質支架越來越受到重視，被用于各種類型受損組織和器官的修復與再生［6-8］。軟骨脫細胞基質（Acellular cartilage matrix，ACM）具有天然的促軟骨形成微環境，是最理想的軟骨組織工程支架材料。骨髓基質干細胞（Bone marrow stromal cells，BMSCs）具有軟骨定向分化潛能，是一種理想的種子細胞來源。

本研究將脫細胞處理后的軟骨組織粉末以不同比例與明膠（Gelatin，GT）溶液混合并交聯，制成多孔仿生三維支架。接種山羊BMSCs 后體外短期誘導，觀察細胞在支架上的黏附、分布與基質分泌情況，并評估BMSCs 的成軟骨分化能力，為ACM 支架復合BMSCs 體外再生軟骨的研究和臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑、儀器與動物

DNase、RNase、抑肽酶、Tris-HCl、Triton X-100、明膠、EDC、NHS（Sigma，美國）；低糖DMEM 培養基、0.25%胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B（Gibco，美國）；胎牛血清、PBS（Hyclone，美國）；DNA 定量試劑盒（Invitrogen，美國）；DAPI（武漢賽維爾生物科技有限公司）。

熒光顯微鏡（Leica，德國）；掃描電鏡（Philips XL-30，荷蘭）；力學分析儀（Instron，美國）；真空冷凍干燥機（上海億倍實業發展有限公司）；全自動冷凍研磨儀（上海凈信實業發展有限公司）。

6 月齡山羊1 只（上海甲干生物科技有限公司）。所有動物實驗方案均經過上海交通大學醫學院動物實驗管理委員會批準。

1.2 軟骨脫細胞基質的制備

新鮮的牛肩胛軟骨在去除表面多余筋膜與結締組織后浸入液氮中5 min，冷凍研磨儀將軟骨組織研磨成細粉末，留取部分軟骨片用于驗證脫細胞效率。隨后進行脫細胞處理：0.5%（w／V）胰蛋白酶／PBS溶液在37 ℃中持續振蕩24 h，每4 h 更換新鮮的胰蛋白酶溶液。PBS 洗滌，核酸酶溶液（50 U／mL DNase、1 U／mL RNase 溶于10 mmol／L Tris-HCl，pH＝7.5）37 ℃振蕩4 h。10 mmol／L Tris-HCl 溶液（含10 U／mL抑肽酶）37 ℃振蕩20 h。1%（v／V）Triton X-100／PBS 37 ℃振蕩24 h。PBS 洗滌6 個循環，每次2 h。離心后將沉淀冷凍干燥制成ACM 粉末。

1.3 軟骨脫細胞效率的評估

1.3.1 組織學評估

將未脫細胞的天然軟骨與脫細胞處理后的軟骨片以4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，常規石蠟包埋，5 μm 切片，行HE 染色。

1.3.2 細胞核熒光染色

將未脫細胞與脫細胞的軟骨片以4%多聚甲醛于室溫下固定，PBS 洗滌3 次。加入少量DAPI 染液，用量以覆蓋軟骨片表面為準，室溫下染色5 min。吸除DAPI 染液，PBS 洗滌3 次，每次5 min。置于熒光顯微鏡下觀察細胞核染色情況。

1.3.3 DNA 定量檢測

使用DNA 定量試劑盒，按操作說明熒光酶標儀檢測未脫細胞與脫細胞處理后軟骨的DNA 含量。

1.4 不同比例ACM／GT 支架的制備

GT 用去離子水在37 ℃中振蕩溶解，配成0.8%的GT 溶液，并按一定比例加入ACM 粉末（表1），混勻后冷凍干燥處理，EDC-NHS 交聯，制成直徑8 mm、厚度2 mm 的圓柱狀支架，環氧乙烷消毒備用。

1.5 不同比例ACM／GT 支架的表征分析

1.5.1 孔徑大小評估

SEM 觀察并拍攝各組支架材料的表面微觀結構，每組平行測量3 個樣本。Image-J 軟件分析圖片，選取不同視野的50 個孔隙測量各組孔徑。

1.5.2 孔隙率評估

一定體積的無水乙醇裝入一帶有刻度的試管，將支架材料浸入無水乙醇中，2 h 后記錄刻度變化為V1，取出支架材料后記錄刻度變化為V2，孔隙率＝（V2-V1）／V2×100%，每組平行測量3 個樣本。

1.5.3 生物力學評估

將支架材料置于力學分析儀上，沿垂直方向以0.5 mm／min 的速度向樣本施壓，直至樣本破碎。根據力-位移曲線計算得出各組的楊氏模量，每組平行測量3 個樣本。

1.5.4 降解速率評估

稱量并記錄各組樣本的初始重量M0，然后將樣本置于PBS 中37 ℃恒溫孵育，第1、7、14、28 天取出樣本用去離子水徹底浸泡洗滌，冷凍干燥后稱量并記錄m1。計算各組樣本在不同時間點的質量損失，質量損失率＝（m0-m1）×100%，每組平行測量3個樣本。

1.6 細胞的獲取與細胞支架復合物的制備

無菌條件下抽取山羊髂前上棘骨髓血15～20 mL，等體積比加入含10% 胎牛血清的低糖DMEM，1 500 r／min 離心5 min，吸除上層脂肪層。按每皿2 mL 骨髓血接種于10 cm 培養皿中，第5 天細胞貼壁后全量換液，隨后擴增并傳代，取第二代BMSCs 備用。

將第二代山羊BMSCs 制成6×107個／mL 的細胞懸液，均勻接種在消毒過的支架材料上，37 ℃、5%CO2環境下孵育4 h，后加入成軟骨誘導培養基（含10 ng／mL 轉化生長因子β1，40 ng／mL 地塞米松，100 ng／ml 胰島素樣生長因子-1 等；無血清）體外培養。第1、7、14 天SEM 觀察細胞在支架內的黏附、分布與基質分泌情況。

1.7 成軟骨分化能力評估

收集體外培養14 d 后的各組樣本，按試劑盒說明書提取樣本RNA，并行反轉錄PCR 分析。檢測成軟骨相關基因ACAN、COLⅡA1、Sox9，β-actin 設為內參（表2）。

1.8 統計學分析

采用SPSS 25.0 軟件進行統計學分析，組間比較采用t檢驗及單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

表2 PCR 引物序列Table 2 PCR primer sequence

2 結果

2.1 軟骨脫細胞效率的評估

未脫細胞的天然軟骨HE 染色可見深藍色軟骨細胞核；ACM 則可見軟骨陷窩內無細胞（圖1A、B）。未脫細胞天然軟骨在DAPI 染色后經熒光激發可見散在發藍光的軟骨細胞核；ACM 在DAPI染色后熒光激發未見細胞核（圖1C、D）。DNA 定量數據顯示經脫細胞處理后DNA 含量與天然軟骨相比下降了90%（圖1E）。這些結果顯示軟骨細胞已被脫盡。

圖1 脫細胞效率的評估Fig.1 Evaluation of decellularization process

2.2 不同比例ACM／GT 支架的表征分析

各組ACM／GT 支架直徑約8 mm，厚度約2 mm，大體外觀無明顯差異。SEM 顯示各組孔徑分布較為均勻，孔徑大小有所差異（圖2）。

圖3 不同混合比例ACM／GT 支架的表征分析Fig.3 Characteristics of ACM／GT scaffolds with different proportions

G1A2 較單純明膠孔徑有所減小，隨著ACM 比例的增加，孔徑逐漸增大。G2A2 孔徑與單純明膠相近，分別為（249±21）μm 和（251±22）μm（圖3 A）。除G1A2 孔隙率有所上升外，其余組孔隙率無明顯差異，均在85%以上，適合軟骨生長（圖3B）。同時，隨著ACM 比例增加，支架材料的力學強度逐漸減小（圖3C）。各組支架在第1 天時質量損失均在10%以下，之后隨著ACM 比例的增加，降解速率增快，其中G1A2 在第14 天時支架已經破碎，無法維持固定形態（圖3D）。

各組不同比例ACM／GT 中，G2A2 的孔徑、孔隙率、力學強度、降解速率均適宜軟骨體外再生，因此選取G2A2 進行體外構建再生軟骨。

2.3 支架材料的生物相容性

SEM 結果顯示，第1 天時細胞呈球狀黏附在支架材料表面，同時伴隨有少量的基質分泌；第7 天時細胞進一步鋪展，均勻分布在支架表面，基質分泌進一步增加；第14 天時，細胞基質已將材料表面完全覆蓋。同時，G2A2 組較單純明膠有更為豐富的基質分泌（圖4）。

圖4 細胞-支架復合物的大體觀及掃描電鏡觀察Fig.4 Gross view and SEM observation of cell-scaffold constructs

2.4 ACM／GT 支架對BMSCs 成軟骨分化的影響

使用qRT-PCR 對BMSCs 成軟骨分化相關基因進行檢測。結果顯示，與單純明膠相比，G2A2 的ACAN、COLⅡA1、Sox9 的mRNA 表達水平均有顯著上調，顯示了ACM 的存在促進了BMSCs 的成軟骨分化（圖5）。

圖5 成軟骨相關基因的表達Fig.5 Expression of chondrogenesis related genes

3 討論

外傷、炎癥、衰老所造成的軟骨損傷一直是臨床上非常棘手的難題。為了有效地修復軟骨損傷，缺損的區域需要填充一定體積與力學強度的修復組織［9］。軟骨組織工程技術可以在體外構建各方面與天然組織相似的再生組織，為臨床治療軟骨缺損提供了新的途徑［10］。種子細胞和支架材料是組織工程技術的重要組成部分，為良好的修復效果提供了物質基礎。

目前用于軟骨組織工程的種子細胞來源主要是軟骨細胞和具有軟骨定向分化潛能的干細胞，如BMSCs 等。由于軟骨細胞自體來源有限，且取材較為困難，無法獲取足夠數量的活性細胞，臨床應用受限［11-12］。BMSCs 獲取途徑方便，且細胞增殖速度快。以往研究已經證實BMSCs 在關節軟骨微環境的調節下可以修復軟骨缺損［13］。因此，本研究選取山羊BMSCs 作為種子細胞來源。

支架材料也是組織工程另一個具有關鍵作用的組成部分。理想的支架材料需要滿足以下要求：①具有三維多孔結構及合適的孔徑、孔隙率以供細胞生長；②一定強度的力學支撐以維持再生組織的形態；③合適的降解速率，在保持再生組織三維形態的條件下減少進入體內后的炎癥反應；④良好的生物相容性；⑤與天然組織相似的仿生微環境。常用于組織工程再生修復的支架材料主要包括人工合成材料和天然可降解材料。人工合成材料，如PGA、PLA、PLGA 等，其降解產物具有一定的細胞毒性，不利于細胞活性維持和組織的良好再生。天然可降解材料具有良好的生物相容性，有利于細胞的黏附與增殖［14］。近年來，組織工程領域出現了一種新的趨勢，即將脫細胞基質作為組織再生的支架材料。各種類型的脫細胞基質可以為細胞提供獨特的天然微環境，以幫助干細胞的分化和組織再生［15］。但由于軟骨組織較為致密，直接將大塊軟骨進行脫細胞處理很難達到理想的脫細胞效果，而殘留的細胞成分會引起強烈的免疫反應，因此通常將軟骨粉碎至粉末狀以提升軟骨組織的脫細胞效率［16-17］。而單獨應用ACM 粉末很難將其塑形為具有一定三維立體形狀的支架材料，因此本研究混合了一定比例的GT溶液以提升ACM 的交聯性能，經冷凍干燥成功制備出了具有圓柱狀三維形態的ACM／GT 多孔仿生支架。結果顯示，不同混合比例的ACM／GT 支架在孔徑、孔隙率、力學強度、降解速率等方面均有所差異，因此選取各方面參數最適宜軟骨再生的G2A2 進行體外構建再生軟骨。有研究表明，脫細胞軟骨片復合自體BMSCs 可以有效修復關節軟骨缺損［18］。然而，粉碎后的ACM 粉末是否仍然保留BMSCs 的軟骨定向誘導作用猶未可知。

本研究將G2A2 支架與山羊BMSCs 復合，體外成軟骨誘導14 d。SEM 顯示細胞在支架上逐漸鋪展、增殖，基質分泌逐漸增多，支架的生物相容性良好。qRT-PCR 顯示，G2A2 上調了BMSCs 成軟骨相關基因的表達，促進了BMSCs 的成軟骨分化。對于ACM 促進軟骨形成的機制，目前知之甚少。所提出的假設主要有：①ACM 對細胞形態的影響；②ACM中殘留的生長因子；③ACM 的天然微觀結構；④ACM中生化成分（糖胺聚糖和膠原）的影響［19］。

綜上所述，ACM 可以制成適宜軟骨再生的三維多孔仿生支架，且能有效誘導BMSCs 的成軟骨分化，是一種理想的軟骨組織工程支架材料，為進一步的臨床應用提供了依據。