PAX6 基因過表達促進大鼠骨髓內皮祖細胞向角膜內皮細胞分化

周夢 余菲 邵春益 傅瑤

角膜內皮是位于角膜和前房房水間的單層細胞結構，它的泵功能和屏障功能對維持角膜的透明起著至關重要的作用［1-2］。角膜內皮細胞在人體內維持終身無復制狀態，當臨床上的常見疾病如大泡性角膜病變、Fuch 角膜變性等使得細胞數量低于臨界值時，會引起患者角膜水腫，嚴重時損傷視功能［3］。目前，此類疾病主要的治療方法仍然是穿透性角膜移植手術或角膜內皮移植，但供體角膜的缺乏限制了移植手術的開展。在角膜替代組織缺乏的現狀下，組織工程角膜受到了廣泛的關注，種子細胞、生物相容性佳的載體、利于細胞生長的環境是組織工程角膜主要的三個因素，而在這其中，獲得足夠量的種子細胞是至關重要的一環。內皮祖細胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）是一種來源于成人外周血和骨髓的干細胞，作為分化為成熟血管內皮細胞的中間狀態，其在心血管疾病領域被廣泛研究［4］。內皮祖細胞可在體外大量獲得和增殖，是組織工程種子細胞的理想來源，近年來也被用于角膜組織工程研究［5］。PAX6 基因在正常的人眼球發育過程中具有非常重要的作用，參與細胞的增殖、遷移和分化等過程，與角膜細胞的功能密切相關［6］。本研究通過觀察大鼠骨髓內皮祖細胞在轉染PAX6 基因后向角膜內皮細胞轉分化的過程，探討其作為組織工程角膜種子細胞的可能性。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑和儀器

4 只雌性4 周齡SD 大鼠（上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院SPF 級動物中心）。本研究符合動物實驗倫理原則。本研究中病毒轉染部分由吉滿生物科技（上海）有限公司進行。

EMG-2（Lonza 公司，瑞士），Histopaque（Sigma-Aldrich 公司，美國），纖連蛋白（BioSource 公司，美國），5% Donkey Serum（Jackson 公司，美國），CD31、CD34、CD133 一 抗（Santa Cruz 公 司，美 國），Dil-AcLDL（Invitrogen 公司，美國），FITC-UEA-1（Sigma-Aldrich 公司，美國），DAPI（Vector Labs 公司，美國），BCA 蛋白定量試劑盒（Thermo Scientific 公司，美國），5%脫脂牛奶（北京索萊寶科技有限公司），PAX6、GAPDH 一抗（武漢愛博泰克生物科技有限公司），mRNA 提取試劑盒（上海奕杉生物科技有限公司）。

臺式大容量離心機（Eppendorf 公司，德國），細胞培養箱（Thermo Scientific 公司，美國），超純水儀（Milli-Q Reference，美國），蛋白電泳儀（北京博泰斯生物技術有限公司），蛋白顯影儀（上海天能科技有限公司），紫外／可見分光光度計（NanoDrop 公司，美國），PCR 儀（T3 thermeter 公司，美國），熒光正置顯微鏡（Olympus 公司，日本），制冰機（Scotsman，意大利）。

1.2 大鼠骨髓內皮祖細胞的分離和培養

取4 周齡雌性SD 大鼠，在無菌操作臺中獲取脛腓骨。用無菌1 mL 注射器抽取EMG-2 培養液沖洗兩端關節的骨髓腔直至骨干變白，吸管吹打混勻后將用培養液稀釋的骨髓腔細胞移至15 mL 離心管中，小心加入同體積的Histopaque（1.083 g／mL）密度梯度離心液，400×g、30 min、速度梯度模式離心。離心后的液體分為4 層，從上而下分別為培養液、磨砂色單核細胞層、透明Histopaque 液、紅細胞層。用吸管小心伸入第二層磨砂色單核細胞層，盡可能將細胞吸盡，并置入新的50 mL 離心管中，加入同體積PBS 沖洗，之后250 g、10 min 離心后棄上清液，重復沖洗一次，盡量洗盡Histopaque 液。使用含10%FBS 的EGM-2 培養液重懸細胞，接種于纖連蛋白鋪層的3.5 cm 培養皿，置入37 ℃、5%CO2培養箱中。第4 天全換液，之前保持細胞皿靜置，換液時將未貼壁的細胞洗去，之后每兩天觀察細胞狀態，細胞融合達80%時進行傳代，傳代比例為1 ∶3。

1.3 大鼠內皮祖細胞鑒定

將原代培養至第4 天的內皮祖細胞接種于鋪有細胞爬片的24 孔板中，待細胞融合近80%時用4%多聚甲醛室溫下固定細胞1 h，PBS 清洗3 遍后用含5% Donkey Serum 的PBS 室溫下封閉1 h，PBS 清洗3 遍，用含2%體積的CD31、CD34、CD133 的封閉液（即一抗）在4 ℃環境下孵育過夜。PBS 清洗3 遍后使用相應的二抗室溫下孵育1 h，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

取原代培養至第4 天的內皮祖細胞，吸出培養液，PBS 清洗細胞后加入含2 μL Dil-AcLDL 的200 μL細胞培養液，置于37 ℃培養箱孵育4 h。之后使用10%多聚甲醛室溫下固定15 min，PBS 清洗2 遍，加入含2 μL FITC-UEA-1 的200 μL 培養液，置于培養箱孵育2 h。DAPI 染細胞核10 min，PBS清洗2 遍。熒光顯微鏡下觀察，表達紅綠藍3 種熒光的為陽性細胞。

1.4 PAX6 基因的轉染

取第一代狀態良好的內皮祖細胞接種于3.5 cm培養皿中，待細胞融合近80%時進行病毒轉染。裝載GFP-PAX6（Ad-PAX6）的腺病毒作為實驗組，空載組作為對照組（Ad-GFP）。吸出培養液后，用PBS 清洗2 遍，加入含0.01%（體積分數）病毒的細胞培養液進行病毒轉染，6 h 后觀察細胞形態，熒光顯微鏡下觀察病毒轉染效率。

1.5 免疫印跡實驗（Western blot）

1.5.1 提取細胞蛋白質

以每3.5 cm 培養皿100 μL 的比例配制適量蛋白裂解液RIPA（含1%蛋白酶抑制劑），置于冰上預冷備用。從培養箱中取出待提取蛋白的細胞培養皿，吸去培養液，預冷的PBS 清洗2 遍，加入預冷的蛋白裂解液，使用蛋白刮沿皿底刮除1 遍，后置于冰上裂解10 min，重復2 次。超聲波徹底裂解蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒定量蛋白濃度。

1.5.2 免疫印跡實驗

以每孔25 μg 蛋白的濃度加樣，選取12%的SDS-PAGE 膠，先設置80 V 進行電泳，待蛋白壓成統一直線后加到120 V 電泳，直至跑出目的條帶，轉膜。室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST 清洗3 遍至無封閉液殘留，加入PAX6 和GAPDH 一抗4 ℃孵育過夜。TBST 清洗3 遍，加入種屬相符的二抗室溫下孵育1 h，TBST 清洗3 遍，蛋白顯影儀上進行顯影。

1.6 角膜內皮細胞特征性基因檢測

1.6.1 提取細胞mRNA

全過程使用mRNA 提取試劑盒。從培養箱中取出待提取蛋白的細胞培養皿，吸去培養液，PBS 清洗2 遍。每孔加入500 μL 裂解緩沖液，置于冰上裂解5 min，加入500 μL 無水乙醇，吸管反復吹打后移入試劑盒中附有的提取柱中。12 000×g離心1 min，倒出廢液，加入500 μL 洗滌液，清洗2 遍，加入20 μL洗脫緩沖液，12 000×g離心1 min 得到mRNA提取液。使用TaKaRa 試劑盒（寶日醫生物技術有限公司）反轉錄mRNA 為cDNA，先測得mRNA 的濃度，根據濃度加入各種成分試劑，于機器中設置好反轉錄的3 個過程及溫度時長，待過程結束后獲得cDNA。

1.6.2 實時熒光定量PCR

Pubmed 基因庫中設計AQP-1、ZO-1、ATP1A1、SNAI1、SNAI2 共5 種mRNA 的引物（AQP-1：ACCTGCT GGCCATTGACTAC，CCAGGGCACTCCCAATGAAT；ZO-1：CGCTAAAGGGAGGAAGTTGTGA，CCAGGTTG GAGGAAGCAGAAA；ATP1A1：AAGAACCCAAACGCA TCGGA，TTGCCGTGGAGGAGGATAGA；SNAI1：AGT TGTCTACCGACCTTGCG，TGCAGCTCGCTATAGTTGG G；SNAI2：CCTCATCTTTGGGGCGTGTA，ATGGCATG GGGGTCTGAAAG），使用轉染空載組病毒的細胞作為對照組，轉染PAX6 基因的細胞作為實驗組，各組加入5 種目的基因的引物，并以GAPDH 引物作為內參進行校準。上機選擇程序，得到原始循環數后使用ΔΔCt 值作圖。

1.7 統計學分析

上述實驗均重復3 次以上，每次實驗均包含3個平行組。使用Prism 8 軟件進行統計學分析，組間比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠內皮祖細胞的細胞形態和增殖情況

大鼠內皮祖細胞原代取材后接種細胞皿中12 h后即有細胞貼壁，形態為橢圓形，散落于皿底各處，有的細胞可形成放射狀的生長形態。4 d 后，細胞克隆數增加，形態多呈短梭形，與周圍纖維細胞形態形成明顯差異。8 d 后，細胞密度增大，形態趨于橢圓形，開始形成相互間的連接，克隆直徑明顯增加。12 d 后，克隆直徑進一步增大，細胞趨近鋪路石樣，形態飽滿，相互之間緊密鑲嵌。培養2 周后細胞可長滿培養皿，此時可進行細胞傳代，傳代后的細胞形態與傳代時的接種密度相關，密度過低會使得細胞纖維化（圖1）。

圖1 大鼠內皮祖細胞培養過程Fig.1 Culture process of rat endothelial progenitor cells

2.2 大鼠內皮祖細胞的鑒定

大鼠內皮祖細胞接種于培養皿第4 天，內皮祖細胞特異表達CD31、CD34、CD133。另外，Dil-AcLDL 染色呈紅色，表明細胞可攝取AcLDL，FITCUEA-1 染色呈綠色，雙染色陽性的細胞從功能學方面被認定為EPCs。結合上述結果可表明此種方法培養出的細胞為大鼠內皮祖細胞（圖2）。

2.3 PAX6 基因的轉染和基因表達情況

在熒光顯微鏡下觀察轉染后的內皮祖細胞，選取多個視野。無論在空載組還是過表達PAX6 組中，相差顯微鏡下所呈現的細胞基本呈現綠色熒光，表明細胞轉染效率均達到95%以上。免疫印跡實驗結果也與熒光染色結果一致，在過表達PAX6 組GAPDH 條帶較淺的情況下（即過表達PAX6 組蛋白總量較少），空載組PAX6 蛋白幾乎無表達。結果表明PAX6 成功轉染大鼠骨髓內皮祖細胞（圖3）。

2.4 角膜內皮細胞特征性基因檢測

如圖4 所示，AQP-1、ZO-1、ATP1A1 是3 種代表角膜內皮細胞屏障功能和泵功能的基因，這3 種基因在轉染PAX6 基因的內皮祖細胞中表達均比空載組明顯增多（P＜0.05），表明過表達PAX6 基因的骨髓內皮祖細胞有向角膜內皮細胞分化的趨勢。SNAI1、SNAI2 是2 種纖維化相關的基因，內皮細胞對于此種結締組織標志性基因呈低表達水平，這2種基因在轉染PAX6 基因的內皮祖細胞中表達均比空載組明顯減少（P＜0.05）。

圖2 內皮祖細胞標志物熒光染色Fig.2 Fluorescence staining of endothelial progenitor cell markers

圖3 內皮祖細胞轉染PAX6 基因Fig.3 Endothelial progenitor cells transfected with PAX6 gene

圖4 角膜內皮細胞標志物mRNA 表達水平Fig.4 mRNA expression level of corneal endothelial cell markers

3 討論

人角膜內皮細胞在體內保持終生無復制狀態，常見的大泡性角膜內皮病變及遺傳性的Fuch 角膜營養不良會使得角膜內皮功能性失代償，引起視力模糊乃至視力喪失，目前的最終治療方案仍然是角膜移植［1-3］。近年來，角膜移植手術量雖然呈逐年增長趨勢，但依舊受限于角膜供體不足。構建組織工程角膜為解決這一問題提供了新的可能性。

干細胞具有自我更新能力和多向分化的潛能，是組織工程種子細胞的理想選擇。內皮祖細胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）由Asahara 等［7］于1997 年首次提出，作為血管內皮細胞的前體細胞，除參與胚胎組織的生成外，還代表一群可分化為多種組織內皮細胞的干細胞。EPCs 與造血干細胞共同起源于胚外中胚層，胎兒肝臟是臍血EPCs 最主要的來源，成人外周血和骨髓是成人體內EPCs的主要來源［8］。正常情況下，EPCs 數量較少，需要通過相應的篩選方法富集，常用的有密度梯度離心法和免疫磁珠法，本研究結合前期研究基礎，采用成熟的密度梯度離心法培養大鼠內皮祖細胞。

內皮祖細胞的鑒定表型目前還存在諸多爭議。單獨從形態學上（形成短梭狀或類鋪路石樣的細胞）鑒別缺乏堅實的證據，需輔以進一步的表型特征加以區別。CD34 為Asahara 等［7］首次分離外周血內皮祖細胞使用的特征分子，然而由于成熟的內皮細胞同樣表達CD34，因此單獨的CD34 陽性不具備特異性。Peichev 等［8］在CD34陽性細胞的基礎上發現了CD133 的表型特異性，因為成熟的內皮細胞不表達CD133，因此可作為祖細胞的特征性分子。此外，Dil-AcLD 和FITC-UEA-1 表達雙陽性可在功能學上被認定為內皮祖細胞［9］。本研究結合CD31、CD34、CD133、ac-LDL、UEA-1 染色來鑒定大鼠內皮祖細胞。結果表明，本研究中培養的細胞大量表達內皮祖細胞特異蛋白，可被認定為是大鼠內皮祖細胞。

PAX6 基因最初在研究WAGR 綜合征時被發現。隨后，Ton 等［10］在先天性無虹膜患者中發現此基因的缺失突變。之后大量的研究表明，PAX6 基因在正常的人眼球發育過程中起非常重要的作用，參與細胞的增殖、遷移和分化等過程，這些活動與角膜細胞的功能密切相關［11-13］。2014 年，Ouyang等［14］發現WNT7A 和PAX6 對角膜上皮細胞的活動至關重要。2020 年，Yu 等［15］通過研究發現角膜內皮細胞在損傷后PAX6 基因表達明顯升高，并通過SUMO 化修飾調控其功能。因此，我們推測PAX6 基因對角膜內皮細胞的分化可能產生相應的影響。本研究證實，轉染PAX6 基因的大鼠骨髓內皮祖細胞表達AQP-1、ZO-1、ATP1A1 等功能性基因，并下調纖維化基因的表達，呈現向角膜內皮細胞分化的趨勢。

本研究通過培養骨髓內皮祖細胞，并使之過表達PAX6 基因，可誘導其向角膜內皮細胞分化，為組織工程角膜種子細胞體外來源不足提供了具有潛力的解決方案，也為角膜移植的進一步發展提供了新的可能性。