基于數據挖掘分析ZC3H13在透明細胞腎細胞癌中的表達及預后意義

孫琰，方久遠，李惠翔

(鄭州大學第一附屬醫院 病理科，河南 鄭州 450000)

腎細胞癌是起源于腎小管上皮的一組惡性腫瘤，約占腎臟惡性腫瘤的90%[1]。透明細胞腎細胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)、乳頭狀腎細胞癌(papillary renal cell carcinoma，PRCC)、嫌色細胞腎細胞癌(chromophobe renal cell carcinoma，CRCC)是3種常見的腎細胞癌亞型[2]。CRCC預后最好，PRCC次之，而占腎細胞癌70%～80%的ccRCC的預后最差。目前原發性ccRCC的5 a生存率為65%，但一旦發生轉移，5 a生存率下降至10%～20%[3]。隨著分子靶向治療的發展，腎細胞癌作為一組具有廣泛表型變異和瘤內異質性的疾病，有關預后和治療的基因研究顯得尤為重要[4-5]。ZC3H13是一種含有CCCH序列的鋅指蛋白，其特異性的鋅指結構通過與靶點DNA或RNA序列相結合，影響基因的轉錄和翻譯。ZC3H13在胚胎發育、腫瘤發生發展等多種進程中行使不同的功能，與多種疾病和腫瘤相關。ZC3H13突變發生于肺癌、胃腸道腫瘤、卵巢癌、膠質母細胞瘤等多種腫瘤中，影響腫瘤的發生、進展及預后[6-8]。Zhu等[9]在117例大腸癌患者中檢測到ZC3H13體細胞框架移位突變，并且發現該突變可能通過Ras-ERK信號通路影響預后。但ZC3H13在ccRCC中的表達及對預后的影響尚不明確。本研究利用Ualcan數據庫和HPA數據庫挖掘分析ZC3H13mRNA及蛋白在ccRCC中的表達及其與預后的關系，并利用GEPIA數據庫加以驗證，最后應用生物信息學方法預測ZC3H13在腎細胞癌中可能存在的作用機制。

1 資料與方法

1.1 Ualcan數據庫挖掘分析Ualcan數據庫(http://Ualcan.path.uab.edu/)是一個基于TCGA數據庫的癌癥數據在線分析和挖掘網站。本研究利用Ualcan數據庫挖掘分析ZC3H13在ccRCC中的表達并進行差異性分析、生存分析和共表達分析，設置檢索條件為：(1)選擇scan by gene；(2)enter gene symbol輸入ZC3H13；(3)TCGA database選擇KIRC、KIRP、KICH。

1.2 HPA數據庫挖掘分析人類蛋白質圖譜(Human Protein Atlas，HPA)數據庫(http://www.proteinatlas.org/)是一個基于蛋白組學和轉錄組學的大型蛋白組和轉錄組數據庫，包含上萬種人類蛋白質的分布和表達信息，可以利用RNA測序和免疫組化分析腫瘤與正常組織之間的差異性表達。本研究利用HPA分析ccRCC組織及對照組織中ZC3H13蛋白的定位及表達情況。

1.3 GEPIA數據庫驗證分析GEPIA數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)是由北京大學所研發的用于基因表達譜數據的動態分析數據庫。本研究利用GEPIA分析來自TCGA數據庫中ccRCC的RNA測序數據，進行ZC3H13mRNA差異性分析、相關性分析及生存分析的驗證。

1.4 STRING在線分析利用STRING在線數據庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)研究ZC3H13相關蛋白質之間的相互作用。本研究檢索條件設置為：(1)選擇protein by name；(2)protein name輸入ZC3H13；(3)Organism選擇Homo sapiens。

2 結果

2.1ZC3H13mRNA在RCC中的表達相比正常腎臟組織，ZC3H13mRNA在腎細胞癌中呈低表達。Ualcan數據庫結果顯示，在ccRCC、PRCC、CRCC中，ZC3H13mRNA表達水平均下調(P<0.05)，見圖1。GEPIA數據庫結果顯示，相比正常腎組織，ZC3H13mRNA在ccRCC、PRCC、CRCC這3種亞型腎細胞癌中表達水平均下調(P<0.05)，見圖2。

A為ZC3H13 mRNA在ccRCC組織和正常腎臟組織中的表達水平比較，P=3.699×10-9；B為ZC3H13 mRNA在PRCC組織和正常腎臟組織中的表達水平比較，P=4.210×10-6；C為ZC3H13 mRNA在CRCC組織和正常腎臟組織中的表達水平比較，P=6.756×10-4；ccRCC為透明細胞腎細胞癌；PRCC為乳頭狀腎細胞癌；CRCC為嫌色細胞腎細胞癌。

圖2 GEPIA數據庫中ZC3H13 mRNA在不同類型腎細胞癌中的表達情況

2.2ZC3H13mRNA在ccRCC中的表達與臨床病理特征的關系在ccRCC中，Ualcan數據庫按照性別、年齡、種族、腫瘤分期、腫瘤分級、腫瘤分型、轉移情況分組進行ZC3H13mRNA表達的差異分析，結果顯示，ZC3H13mRNA的表達在ccRCC患者不同分期、腫瘤分型、組織學分級中存在差異。Ualcan數據庫結果顯示：Ⅰ期ccRCC患者ZC3H13mRNA表達水平高于Ⅲ期者(P<0.05)；ZC3H13mRNA在其他分期中的表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3A；與ccA型比較，ccB型ccRCC患者的ZC3H13mRNA表達水平較低(P<0.05)，見圖3B；ccRCC患者的組織學分級與ZC3H13mRNA的表達水平有關，相比于低組織學分級患者，具有高組織學分級患者的ZC3H13mRNA表達水平降低(P<0.05)，見圖3C。在GEPIA數據庫中，隨著ccRCC腫瘤分期的增高，ZC3H13mRNA的表達量逐漸下降(P<0.05)，見圖4。

2.3ZC3H13mRNA在ccRCC中的表達與預后的關系Ualcan數據庫挖掘性分析發現，在ccRCC中，與ZC3H13mRNA高表達組比較，ZC3H13mRNA低表達組生存期較短(P<0.05)，見圖5。GEPIA驗證性分析發現，在ccRCC中，與ZC3H13mRNA高表達組比較，ZC3H13mRNA低表達組的總生存期和無瘤生存期下降(P<0.05)，見圖6。

A為不同腫瘤分期ccRCC的ZC3H13 mRNA表達情況；B為不同腫瘤分型ccRCC的ZC3H13 mRNA表達情況；C為不同組織學分級ccRCC的ZC3H13 mRNA表達情況。

圖4 GEPIA數據庫中ZC3H13 mRNA在不同腫瘤分期的ccRCC中的表達

圖5 Ualcan數據庫中ccRCC患者ZC3H13 mRNA表達水平與生存期的關系

A為ZC3H13 mRNA表達水平與ccRCC患者總生存期的關系；B為ZC3H13 mRNA表達水平與ccRCC患者無瘤生存期的關系。

2.4 ZC3H13蛋白在ccRCC中的定位HPA數據庫結果顯示，在A-431腫瘤細胞系中，ZC3H13主要定位于核膜和肌動蛋白絲。利用免疫組化抗體(HPA047806)分析ZC3H13在腎細胞癌和正常腎臟組織中的表達，結果顯示，ZC3H13蛋白主要表現為細胞核著色，部分胞質輕微著色。

2.5ZC3H13基因的共表達分析首先利用Ualcan數據庫對ZC3H13進行共表達分析，共檢索到6 394個共表達基因，其中包含VHL、PBRM1、mTOR、HIF-1α等在ccRCC發生過程中的關鍵基因。然后利用GEPIA數據庫對Ualcan數據庫中篩選出的共表達基因進行相關性驗證，結果表明ZC3H13與VHL、PBRM1、mTOR、HIF-1α等ccRCC多種關鍵基因呈正相關(P<0.05)，見圖7。

2.6 STRING在線分析利用STRING在線分析ZC3H13與上下游蛋白的相互作用，得到以ZC3H13為中心的蛋白質互作網絡圖(圖8)。蛋白質互作網絡圖主要包括WTAP、POLR2B、KIAA1429等11個基因，其中共涉及35個相互作用節點，P(PPI enrichmentP)=1.46×10-8。

A為ZC3H13與VHL的相關性分析；B為ZC3H13與PBRM1的相關性分析；C為ZC3H13與mTOR的相關性分析；D為ZC3H13與HIF-1α的相關性分析。

圖8 STRING在線分析以ZC3H13為中心的PPI網絡

3 討論

基因組的表觀遺傳修飾，如組蛋白修飾、RNA修飾和DNA甲基化，在腫瘤的發生和發展中起著關鍵作用[10]。m6A作為一種可逆的mRNA甲基化修飾，受多種調控因子及相關復合物的影響，是真核生物中最常見的內部修飾方式，并在肝癌、肺癌、食管癌等多種腫瘤中發揮作用[11-12]。Chen等[13]研究發現，一些m6A甲基化調節劑在ccRCC中異常表達，并可作為ccRCC患者預后分層的潛在生物標志物。ZC3H13是一種參與m6A修飾甲基轉移酶復合物形成的重要調控蛋白，定位于染色體13q14.13，與多種疾病和腫瘤相關。研究表明，ZC3H13通過C端與WTAP、Virilizer和Hakai的相互作用，參與m6A甲基化水平的調控，從而影響胚胎干細胞的自我更新過程[14]。ZC3H13在多種疾病中異常表達，如特發性血小板增多癥、精神分裂癥、膠質瘤、胃腸道腫瘤等[15-17]。在結腸癌中，ZC3H13作為腫瘤抑制因子，可能作為上游調控因子參與Ras-ERK信號通路的調控，抑制腫瘤細胞的侵襲和增殖。ZC3H13的表達下調與結腸癌患者的TNM分期和局灶淋巴結轉移有關[18]。由此推斷，ZC3H13可能在ccRCC中也存在差異性表達并可能影響患者預后。隨著高通量測序的發展，各種數據庫在醫學研究中的使用也越來越多。本研究利用來自TCGA數據庫的腫瘤基因芯片信息，通過Ualcan數據庫的挖掘和GEPIA數據庫的驗證，初步發現ZC3H13mRNA在結直腸癌、腎癌、膠質瘤等多種腫瘤中差異表達。本研究結果顯示，在ccRCC、PRCC、CRCC這3種亞型的腎細胞癌中，ZC3H13mRNA的表達水平低于正常腎臟組織。在ccRCC中，ZC3H13mRNA低表達組具有較短的總生存期和無瘤生存期，由此推測ZC3H13mRNA低表達與不良預后相關。此外，隨著腫瘤分期和組織學分級的遞增，ZC3H13mRNA表達水平呈下降趨勢，這說明ZC3H13mRNA的低表達提示著腫瘤細胞更高的惡性程度和侵襲性。相關研究曾確定了ccA和ccB兩者不同的ccRCC亞型[19]。既往文獻報道，相對于ccA患者，ccB患者具有更低的總體生存率、癌癥特異性生存率和無復發生存率[20]。在本研究進行數據庫挖掘時發現，ccB亞型ZC3H13mRNA表達水平相對較低，這進一步提示ZC3H13mRNA低表達與不良預后有關。在蛋白質水平上，ZC3H13主要定位于細胞核膜和肌動蛋白絲，在ccRCC中以低表達為主，這與mRNA水平結果相一致。

從遺傳學角度上來說，ccRCC來源于多個抑癌基因的相繼缺失，VHL的失活和染色體3p的缺失是最先被發現的致癌事件[21]。VHL基因位于染色體3p25.3上，與散發性ccRCC相關，約90%的ccRCC存在VHL基因缺失，其突變通常伴隨染色體3p的缺失[22-23]。VHL基因的缺失是ccRCC發生發展的早期事件，與腫瘤血管生成有關，是ccRCC發生、發展中的關鍵基因。在散發性ccRCC中，VHL基因的失活導致HIF-1α的異常表達，造成相關蛋白酶的降解，還會引起VEGF和PDGF表達水平上調而產生更多的新生血管[24]。在ccRCC患者中，HIF-1α的表達與腫瘤臨床分期和病理分級有關，其陽性表達組具有較低生存率和不良預后[25]。HIF-1α與胰腺癌、乳腺癌、ccRCC等多種腫瘤的預后相關[26-27]。這為腎細胞癌的治療提供了新的方向和靶點。PBRM1是與VHL位于同一條染色體臂上的基因，作為一個腫瘤雙重抑制基因，在約45%的ccRCC中發生突變[28]。PRBM1在腫瘤中低表達，是影響ccRCC預后的不良因素。在腎細胞癌中存在mTOR活性和自噬水平不同程度的升高。mTOR是一種氨基酸蛋白激酶，參與細胞的生長、代謝等多種生物學過程，也是mTOR信號通路中重要的調控因子。mTOR參與的PI3K-AKT-mTOR信號通路調節細胞的衰老和能量代謝，并與ccRCC密切相關[29]。隨著免疫及靶向治療的興起，mTOR成為治療ccRCC的一個熱門靶點[30]。mTOR抑制劑在ccRCC患者中已取得了一定的療效，對改善患者預后具有重要意義[31]。本研究對ZC3H13基因進行共表達分析發現，VHL、PBRM1、mTOR、HIF-1α與ZC3H13共同表達于ccRCC中。利用GEPIA數據庫進行了相關性分析，發現ZC3H13與VHL、PBRM1、mTOR、HIF-1α存在明確的相關性。VHL、PBRM1、mTOR、HIF-1α是影響ccRCC發生、發展和預后的關鍵基因。ZC3H13是m6A甲基化的重要基因，其低表達與ccRCC的腫瘤分期、組織學分級等相關并影響患者的生存期。因此，推測ZC3H13是影響ccRCC患者預后的潛在標志物，對其進一步研究有利于評估腎癌患者的預后。STRING在線分析結果顯示，ZC3H13與多種互作蛋白共同參與RNA代謝、mRNA甲基化、雄激素受體信號通路等生物學途徑，進一步提示ZC3H13可能通過影響RNA修飾及甲基化等過程在ccRCC中發揮作用。

總之，利用生物信息學的方法發現ZC3H13表達與ccRCC的臨床病理特征及生存期相關。ZC3H13低表達提示腫瘤細胞有更高的侵襲性和不良預后。ZC3H13作為與VHL、PBRM1、mTOR、HIF-1α等多種ccRCC的經典基因相關的一個新基因，是未來評估ccRCC患者預后和靶向治療的潛在分子標志物，這為患者的預后監測和治療提供了新的方向。