垂盆草總黃酮對APAP 誘導小鼠肝損傷的保護作用

蔣志濤，王 雪，韓 怡，潘金火，柳春娣?

（1.南京中醫藥大學附屬張家港醫院藥學部，江蘇省研究生工作站，江蘇張家港 215600；2.南京中醫藥大學藥學院，江蘇南京 210023）

肝臟是人體最大的臟器，對人體的生理功能調節有重大作用，藥物濫用、嗜酒以及長期暴露于有毒環境等都會對肝臟造成損傷［1-2］。藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）是指藥物或其代謝產物引起的肝功能異常或肝臟對藥物及代謝產物的超敏反應所致的疾病［3］。藥物性肝損傷是常見的嚴重的藥物不良反應之一，重者可致肝硬化、肝癌、急性肝衰竭甚至死亡，其發病率逐年上升，往往是多種機制先后或共同作用的結果，迄今仍缺乏簡便、客觀、特異的診斷指標和特效治療手段［4］。大量研究表明，天然藥物和中藥在治療肝損傷方面顯示出可靠的療效和較少的不良反應［5］。

垂盆草為景天科景天屬植物垂盆草Sedum sarmentosum Bunge 的干燥全草，最早在清代趙學敏的《本草綱目拾遺》 中有相關記載，收載于歷版《中國藥典》，具有極高的藥用價值［6］。垂盆草總黃酮是垂盆草的主要活性部位之一，具有保肝降酶、抗腫瘤、抗氧化等功效［7］。相關研究表明，垂盆草總黃酮對于肝纖維化的治療具有明確療效，但垂盆草總黃酮抗藥物性肝損傷的藥理作用尚未見報道。因此本實驗通過建立對乙酰氨基酚誘導的小鼠藥物性肝損傷模型，研究垂盆草總黃酮對藥物性肝損傷小鼠肝臟的保護作用。

1 材料

1.1 儀器 TD6001 電子天平（天津市天馬儀器廠）；FA1004 電子分析天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；SPECTRAMAX190 酶標儀［美谷分子儀器（上海）有限公司］；HH-2 數顯恒溫水浴鍋（江蘇常州國華電器有限公司）；ZD-9556 水平搖床（太倉市華利達實驗設備有限公司）；DHG-9023A 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；HX11L-120 立式壓力蒸汽滅菌器（上海華線醫用核子儀器有限公司）；LE438-2M PH 計［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；85-2 磁力攪拌器（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；DYY-6C 型電泳儀電源（北京市六一儀器廠）；XHF-D 高速分散器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Allegra X-30R 冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）；3D HISTECH Pannoramic 250 掃描儀（匈牙利Hungary 公司）；5300 凝膠成像系統（上海天能科技有限公司）；ATC 3000 RTPCR 儀（楓嶺國際有限公司）；Nano-100 微量分光光度計（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.2 試劑 谷草轉氨酶（AST）批號為20171220、谷丙轉氨酶（ALT）批號為20171219、乳酸脫氫酶（LDH）批號為20171229、微量還原型谷胱甘肽（GSH）批號為20180116、堿性磷酸酶（ALP）批號為20180105、總膽紅素（TBIL）批號為20180104、過氧化氫酶（CAT）批號為20180105、總超氧化物歧化酶（SOD）批號為20180104、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）批號為20180103、丙二醛（MDA）批號為20180104、白介素6（IL-6，Cat.＃SU-B20818）、白介素1β（IL-1β，Cat.＃SU-B20174）、腫瘤壞死因子α（TNF-α，Cat.＃SU-B20852）試劑盒，以上均購自南京建成生物工程研究所；聯苯雙酯滴丸（北京協和藥廠，批號170609）；對乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）原料藥（武漢貝爾卡生物醫藥有限公司，批號205254）；兔抗鼠Nrf2、HO-1 多克隆抗體及GAPDH 一抗購自美國Abcam 公司，批號分別為GR208500-1、GR374701-4、GR148385-1；山羊抗兔二抗和GAPDH 二抗購自美國proteintech 公司，批號分別為00029255、00 054396；PCR 預混合MIX ［天根生化科技（北京）有限公司，批號N2728］；氯仿（成都市科龍化工試劑廠，批號2016110501）；異丙醇（成都市科龍化工試劑廠，批號2016122201）；Thermo Scientific Revert Aid First cDNA Synthesis Kit ［賽默飛世爾科技（中國）有限公司，批號00306196］；SYBR? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（大連寶萬生物科技有限公司，批號A650 t-1）。垂盆草藥材購于安徽省萬生中藥飲片有限公司，批號161101，經張家港市中醫醫院藥學部余輝主任中藥師鑒定為景天科植物垂盆草Sedum sarmentosum Bunge 的干燥全草。垂盆草總黃酮粉末（自制，由張家港市中醫醫院制劑室制備，批號20180106。制備方法為取適量垂盆草藥材，加8 倍量的80%乙醇回流提取2 次，將提取液減壓濃縮后經石油醚脫脂，調節藥液濃度以及pH，再經大孔樹脂和聚酰胺純化得到。采用紫外分光光度計進行測定，計算得到垂盆草總黃酮的純度約為60%）；通用型組織固定液（武漢谷歌生物科技有限公司，批號172012）。

1.3 動物 SPF 級雄性ICR 小鼠48 只，體質量18～22 g，購于南京市江寧區青龍山動物繁殖場，實驗動物生產許可證號SCXK（蘇）2017-0001；飼養于南京中醫藥大學實驗動物中心，實驗動物使用許可證號SYXK（蘇）2018-0049。所有小鼠均在室溫21～26 ℃，濕度45%～70%的環境中飼養，自由飲水與進食。

2 方法

2.1 藥液制備 稱取垂盆草總黃酮粉末，加0.5% CMC-Na 溶液配制成質量濃度分別為15、30、60 mg／mL 的垂盆草總黃酮混懸液。將聯苯雙酯滴丸研磨成粉末，溶于0.5% CMC-Na 溶液，配制20 mg／mL的溶液。將APAP 溶于生理鹽水，于60 ℃水浴鍋加熱溶解配成30 mg／mL 的溶液備用。

2.2 分組及給藥 ICR 小鼠適應性飼養7 d 后隨機分為6 組，每組8 只，分別為正常組、模型組、陽性藥物組（聯苯雙酯200 mg／kg）、垂盆草總黃酮低劑量組（150 mg／kg）、垂盆草總黃酮中劑量組（300 mg／kg）、垂盆草總黃酮高劑量組（600 mg／kg）。正常組和模型組灌胃10 mL／kg 的0.5% CMC-Na 溶液，其余各組灌胃等容量的相應藥物，每天1 次，連續灌胃7 d，末次灌胃1 h 后，除正常組腹腔注射10 mL／kg 的生理鹽水外，其余各組均腹腔注射300 mg／kg 的APAP 溶液建立小鼠藥物性肝損傷模型，造模后，各組小鼠均禁食不禁水。

2.3 標本采集 APAP 造模24 h 后，將小鼠摘眼球取血，室溫靜置1～2 h，3 000 r／min，4 ℃，離心10 min，制備血清，保存于-80 ℃冰箱中。處死小鼠，取出肝臟進行稱定質量、觀察，計算肝臟指數，同時依照不同需要將樣本保存于相應的環境下，取肝右葉同一部位肝組織置于4%多聚甲醛中固定，用于肝組織病理檢測；用于組織勻漿、實時熒光定量PCR（RT-PCR）、蛋白質印跡（WB）法檢測的標本保存于-80 ℃冰箱中。

2.4 指標檢測

2.4.1 肝臟指數 稱定小鼠體質量及肝臟質量，計算肝臟指數，肝臟指數＝（肝臟質量／體質量）×100%。

2.4.2 血清ALT、AST、ALP、TBIL、LDH 水平嚴格按照試劑盒說明書操作步驟檢測。

2.4.3 肝組織勻漿指標

2.4.3.1 MDA、SOD、GSH、CAT、GSH-PX 水平嚴格按照試劑盒操作說明書處理樣本、進行預實驗和樣本稀釋，利用BCA 蛋白測試盒測定10%肝勻漿蛋白濃度，根據試劑盒操作步驟進行實驗，并根據BCA 蛋白試劑盒所測蛋白濃度計算MDA、GSH、CAT、SOD、GSH-PX 水平。

2.4.3.2 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平 按照相應ELISA 試劑盒說明書操作步驟處理肝組織樣本，測定組織中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。

2.4.4 肝組織病理 取4% 多聚甲醛溶液固定的肝組織，依次脫水，浸蠟、石蠟包埋、切片、HE染色，用掃描儀掃描后觀察肝組織結構。

2.4.5 Real-Time PCR 檢測肝組織Nrf2、 HO-1 mRNA 表達 取50 mg 肝組織，采用Trizol 法提取肝組織的RNA，使用Thermo Scientific Revert Aid First cDNA Synthesis Kit-逆轉試劑盒，按照說明書進行反轉錄，隨后按照RR420 A-takara SYBR?Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒說明書進行實驗，結果采用2-ΔΔCt進行計算。

2.4.6 Western blot 檢測 Nrf2、HO-1 蛋白表達 精密稱取一小塊肝組織，加入預冷的玻璃研磨器中，按照樣本質量∶裂解液體積＝100 mg ∶1 mL的比例加入預冷的含有PMSF 及磷酸酶抑制劑的裂解液，充分研磨提取總蛋白，用BCA 法定量。檢測濃度之后各組取等量蛋白提取液，進行SDSPAGE 凝膠電泳實驗對蛋白進行分離，電泳完成后，按照預染蛋白Marker 所顯示的位置，切取目的蛋白，使用天能標準濕式轉膜裝置在冰浴中將電泳產物轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，取膜并用脫脂奶粉封閉后，將PVDF 膜在一抗中4 ℃孵育過夜，洗膜后加入相應二抗37 ℃孵育1 h，將孵育二抗并清洗完畢的PVDF 膜置于凝膠成像系統內，ECL 發光，運行凝膠成像系統進行曝光。

2.5 統計學分析 實驗數據用SPSS 22.0 軟件進行統計分析，數據以（）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較采用t 檢驗，以P ＜0.05 為差異具有統計學意義。Western blot 檢測結果用Image J 軟件進行分析，計算目的蛋白條帶和GAPDH 的灰度值比值，計算出相對值后導入Graphpad 軟件進一步統計分析［8-9］。

3 結果

3.1 垂盆草總黃酮對肝臟指數的影響 如表1 所示，與正常組比較，模型組小鼠給予300 mg／kg APAP 造模后小鼠肝臟指數增加（P＜0.01）。與模型組比較，垂盆草總黃酮高、中、低劑量組和陽性藥物組均可使肝臟指數下降（P ＜0.05，P ＜0.01）。

表1 垂盆草總黃酮對APAP 致急性肝損傷小鼠肝臟指數的影響（，n＝8）Tab.1 Effects of S.sarmentosum total flavonoids on liver indices of mice with APAP-induced acute liver injury（，n＝8）

表1 垂盆草總黃酮對APAP 致急性肝損傷小鼠肝臟指數的影響（，n＝8）Tab.1 Effects of S.sarmentosum total flavonoids on liver indices of mice with APAP-induced acute liver injury（，n＝8）

注：與正常組比較，＃＃ P ＜0.01；與模型組比較，?P ＜0.05，??P＜0.01。

3.2 垂盆草總黃酮對血清ALT、AST、ALP、LDH、TBIL 水平的影響 如表2 所示，與正常組比較，模型組在APAP 造模24 h 后血清中ALT、AST、ALP、LDH、TBIL 水平增加（P＜0.01），表明小鼠藥物性肝損傷模型復制成功。與模型組比較，垂盆草總黃酮高、中、低劑量組和陽性藥物組能降低ALT、AST、ALP、TBIL 水平（P ＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，垂盆草總黃酮高、中劑量組和陽性藥物組均能降低LDH 水平（P＜0.05，P＜0.01），垂盆草總黃酮低劑量組的LDH 水平也降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 垂盆草總黃酮對APAP 誘導肝損傷小鼠血清ALT、AST、ALP、LDH、TBIL 水平的影響（，n＝8）Tab.2 Effects of S.sarmentosum total flavonoids on serum ALT，AST，ALP，LDH and TBIL levels in mice with APAP-induced acute liver injury（，n＝8）

表2 垂盆草總黃酮對APAP 誘導肝損傷小鼠血清ALT、AST、ALP、LDH、TBIL 水平的影響（，n＝8）Tab.2 Effects of S.sarmentosum total flavonoids on serum ALT，AST，ALP，LDH and TBIL levels in mice with APAP-induced acute liver injury（，n＝8）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3.3 肝組織勻漿

3.3.1 MDA、SOD、GSH、CAT、GSH-PX 水平 如表3 所示，與正常組比較，模型組小鼠給予APAP 造模24 h 后，小鼠肝組織MDA 水平增加（P＜0.01）；與模型組比較，垂盆草總黃酮高、中、低劑量組和陽性藥物組的MDA 水平降低（P ＜0.05，P＜0.01）。與正常組比較，模型組小鼠肝組織SOD、GSH、GSH-PX 和CAT 水平降低（P ＜0.01）；與模型組比較，垂盆草總黃酮高、中、低劑量組和陽性藥物組小鼠肝組織SOD、GSH、GSH-PX 和CAT 水平升高（P＜0.05，P＜0.01）。

3.3.2 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平 如表4 所示，與正常組比較，模型組小鼠肝組織IL-1β、IL-6、TNF-α 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，垂盆草總黃酮高、中、低劑量組和陽性藥物組小鼠肝組織IL-1β、TNF-α 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，垂盆草總黃酮高、中劑量組和陽性藥物組小鼠肝組織IL-6 水平降低（P＜0.01），垂盆草總黃酮低劑量組IL-6 水平與模型組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 垂盆草總黃酮對APAP 誘導肝損傷小鼠肝組織MDA、SOD、CAT、GSH、GSH-PX 水平的影響（，n＝8）Tab.3 Effects of S.sarmentosum total flavonoids on MDA，SOD，CAT，GSH and GSH-PX levels in liver tissue of mice with APAP-induced acute liver injury（，n＝8）

表3 垂盆草總黃酮對APAP 誘導肝損傷小鼠肝組織MDA、SOD、CAT、GSH、GSH-PX 水平的影響（，n＝8）Tab.3 Effects of S.sarmentosum total flavonoids on MDA，SOD，CAT，GSH and GSH-PX levels in liver tissue of mice with APAP-induced acute liver injury（，n＝8）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

表4 垂盆草總黃酮對APAP 誘導肝損傷小鼠肝組織IL-1β、IL-6、TNF-α 水平的影響（，n＝8）Tab.4 Effects of S.sarmentosum total flavonoids on IL-1β，IL-6 and TNF-α levels in liver tissue of mice with APAP-induced acute liver injury（，n＝8）

表4 垂盆草總黃酮對APAP 誘導肝損傷小鼠肝組織IL-1β、IL-6、TNF-α 水平的影響（，n＝8）Tab.4 Effects of S.sarmentosum total flavonoids on IL-1β，IL-6 and TNF-α levels in liver tissue of mice with APAP-induced acute liver injury（，n＝8）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3.4 肝組織病理檢測 如圖1 所示，正常組小鼠肝小葉結構清晰，肝板排列整齊，肝細胞胞質豐富、形態結構正常，肝細胞未見明顯的變性、壞死，未見炎細胞浸潤。模型組肝細胞結構紊亂，組織中多見肝細胞水腫，胞質疏松淡染，可見炎癥細胞浸潤和肝細胞局灶性壞死，核固縮深染，胞質中可見較小的圓形空泡；相比于模型組，陽性藥物組和垂盆草總黃酮高、中、低劑量給藥組肝臟細胞組織都有所恢復，肝臟結構較清楚，少量細胞點狀壞死，肝細胞水腫明顯減輕，仍見少量炎癥細胞浸潤。垂盆草總黃酮高劑量與聯苯雙酯組比較，無明顯差異，說明垂盆草總黃酮能顯著改善小鼠肝細胞變性和壞死。

圖1 垂盆草總黃酮對APAP 所致藥物性肝損傷小鼠肝臟組織學的影響（×20）Fig.1 Effects of S.sarmentosum total flavonoids on liver histology of mice with APAP-induced acute liver injury（×20）

3.5 垂盆草總黃酮對小鼠肝組織Nrf2、 HO-1 mRNA 表達的影響 如圖2 所示，與正常組比較，模型組小鼠肝組織Nrf2、 HO-1mRNA 表達下降（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥物組和垂盆草總黃酮高、中、低劑量組Nrf2、 HO-1 mRNA 水平均增加（P＜0.05，P＜0.01）。

圖2 垂盆草總黃酮對APAP 誘導藥物性肝損傷小鼠Nrf2、 HO-1 mRNA 的影響（，n＝8）Fig.2 Effects of S.sarmentosum total flavonoids on the expressions of Nrf2 and HO-1 mRNA in mice with APAP-induced liver injury（，n＝8）

3.6 垂盆草總黃酮對小鼠肝組織Nrf2、HO-1 蛋白表達的影響 如圖3 所示，與正常組比較，APAP模型組小鼠肝組織Nrf2、HO-1 蛋白表達降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥物組和垂盆草總黃酮高、中、低劑量組均能使Nrf2、HO-1 蛋白表達增加（P＜0.01）。

圖3 垂盆草總黃酮對APAP 誘導藥物性肝損傷小鼠Nrf2、HO-1 蛋白表達的影響（，n＝8）Fig.3 Effects of S.sarmentosum total flavonoids on the expressions of Nrf2 and HO-1 protein in mice with APAP-induced liver injury（，n＝8）

4 討論

APAP 是臨床使用廣泛的解熱鎮痛藥，是導致藥物性肝損傷的常見藥物［10］。APAP 誘導的小鼠藥物性肝損傷模型造模時間短，易復制，穩定性好，是篩選保肝藥物的理想模型［5］。在相關文獻報道中，多數腹腔注射300 mg／kg APAP 造藥物性肝損傷模型，所以在前期預實驗中對APAP 的造模劑量進行了考察。分別考察了200、300、400 mg／kg APAP 腹腔注射的造模效果。實驗中發現，200 mg／kg APAP 腹腔注射后，小鼠血清中ALT、AST 增加不明顯，多數小鼠未造成肝損傷；400 mg／kgAPAP 腹腔注射后，有少量小鼠死亡；300 mg／kg APAP 腹腔注射后，小鼠血清中ALT、AST 水平增加，肝組織結構被破壞，小鼠無死亡。因此正式實驗時選擇腹腔注射300 mg／kg APAP 進行造模。

垂盆草總黃酮是垂盆草的有效部位之一，具有保肝降酶的作用。本研究發現，小鼠分別灌胃不同劑量的垂盆草總黃酮可以降低APAP 引起的小鼠血清中ALT、AST、ALP、LDH、TBIL 水平的增加，降低肝臟指數，顯著改善肝組織病變，這表明垂盆草總黃酮對APAP 導致的藥物性肝損傷具有顯著保護作用。此外垂盆草總黃酮預處理能增加SOD 活性、GSH 水平以及CAT 水平，且降低肝組織MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。MDA 是氧化損傷的一個特殊標志物，其水平的多少可直接反應脂質過氧化的程度，間接反應自由基對細胞的損傷程度［11］。SOD 能夠清除細胞內高濃度的超氧陰離子自由基，GSH 是體內重要的抗氧化劑和自由基清除劑，可把細胞內有害物轉化為無害物并排出［12］。IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎癥因子在急性組織損傷的炎癥過程中扮演著重要角色［13］。綜上，該研究表明垂盆草總黃酮對APAP 肝損傷的保護作用與抑制肝組織的氧化損傷和炎癥反應有關。

核因子E2 相關因子2（Nrf2）是參與調節機體天然抗氧化應激防御系統的主要調控因子［14］。HO-1 是機體和細胞內重要的抗氧化應激酶，其表達受Nrf2 的調控［15］。Nrf2／HO-1 通路在藥物介導的肝損傷中發揮重要作用，是機體最重要的抗氧化應激機制之一。本研究表明，APAP 誘導藥物性肝損傷后，肝組織Nrf2、HO-1 表達水平被顯著抑制，垂盆草總黃酮預防性給藥組，肝組織Nrf2、HO-1蛋白表達增加，表明Nrf2／HO-1 通路被激活以對抗APAP 產生的肝細胞毒性。

綜上所述，垂盆草總黃酮對APAP 所致藥物性肝損傷具有一定的保護作用，其機制可能是抑制肝組織的氧化損傷和炎癥反應，從而起到保護肝臟的作用，詳細機制還需進一步研究。