蒺藜皂苷通過調控lncRNA AGAP2-AS1／miR-646 表達抑制結腸癌細胞的增殖和誘導細胞凋亡

劉經州，楊紅群，宋春俠

（1.承德醫學院附屬醫院，河北承德 067000；2.承德市婦幼保健院，河北承德 067000）

結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，傳統的手術、化療等方法治療結腸癌存在一定的局限性，而中醫藥治療結腸癌有其獨特優勢［1］。因此，研發新的中醫藥對治療結腸癌及提高其療效具有重要意義。蒺藜Tribulus terrestris L.是蒺藜科植物蒺藜屬植物，傳統中藥之一，蒺藜皂苷是從蒺藜中提取出的主要活性成分之一，其具有抗癌、治療心血管疾病的作用［2］。研究報道蒺藜皂苷能通過影響細胞周期及誘導細胞凋亡抑制卵巢癌細胞的增殖［3］。蒺藜總螺甾皂苷能抑制人卵巢透明細胞癌荷瘤裸鼠腫瘤作用［4］。蒺藜的皂苷提取物可誘導人乳腺癌MCF-7 細胞導凋亡［5］。但蒺藜皂苷對結腸癌增殖、凋亡的影響及其機制還尚不清楚。研究報道lncRNA AGAP2-AS1 在結直腸癌組織和細胞中上調表達，促進結直腸癌細胞的增殖［6］。沉默AGAP2-AS1 可抑制膠質母細胞瘤細胞增殖和侵襲，同時增強細胞的凋亡［7］。miR-646 在結直腸癌組織和細胞系中下調表達，高表達miR-646 可抑制結直腸癌細胞增殖和遷移［8］。因此，本實驗旨在研究蒺藜皂苷對結腸癌增殖、凋亡的影響及其機制是否與lncRNA AGAP2-AS1 和miR-646 有關。

1 材料與方法

1.1 材料 結腸癌細胞株HCT116（上海冠導生物工程有限公司，批號C00135507）；DMEM 培養基（美國Sigma 公司，貨號EY-4648）；蒺藜皂苷（純度≥98%，上海同田生物技術股份有限公司，貨號E-3190）；四甲基偶氮唑鹽比色法（methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT）試劑盒（德國IBL公司，貨號JKSJ—1812）；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素／碘化丙錠（Annexin V-Fluorescein isothiocyanate／propidium iodide，Annexin V-FITC／PI）凋亡檢測試劑盒（日本同仁研究所，貨號AD10-2）；二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒（上海研謹生物科技有限公司，貨號YPA101-01）；一步法熒光定量PCR 試劑盒（美國GENMED 公司，貨號GMS12113）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，貨號KFS303-ZPR）。

1.2 細胞處理與分組 結腸癌細胞株HCT116 用含10% 胎牛血清的DMEM 培養液在37 ℃、5%CO2孵育箱中培養，取對數生長期細胞HCT116，分別用20、40、80 mg／L 的蒺藜皂苷處理作為蒺藜皂苷低、中、高劑量組，不做任何處理的細胞作為對照組。

取生長狀態良好且密度達到80% 左右的HCT116 細胞進行轉染，分別將10 μg 的AGAP2-AS1 過表達對照質粒（pcDNA）、AGAP2-AS1 過表達質粒（pcDNA-AGAP2-AS1）、AGAP2-AS1 抑制表達對照質粒（si-NC）、AGAP2-AS1 抑制表達質粒（si-AGAP2-AS1）、miR-646 模擬物對照質粒（miR-NC）、miR-646 模擬物（miR-646）分別加入100 μL 不含血清的培養液；將50 μg 脂質體也用不含血清的培養液稀釋至100 μL；將上述2 種溶液輕輕混合在一起，室溫靜置10 min，將上述混合物小心加入到培養皿中，分散均勻，置于37 ℃，5% CO2的培養箱中培養；分別記為pcDNA 組、pcDNA-AGAP2-AS1 組、si-NC 組、si-AGAP2-AS1組、miR-NC 組、miR-646 組。

將pcDNA、pcDNA-AGAP2-AS1 按上述方法轉染至細胞HCT116 中再用80 mg／L 的蒺藜皂苷處理，記為蒺藜皂苷+pcDNA 組、蒺藜皂苷+pcDNAAGAP2-AS1 組。

1.3 MTT 檢測細胞增殖抑制率 各組細胞培養至48 h 時，每孔分別加入20 μL 的MTT 溶液，于培養箱中繼續孵育4 h 后棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，振蕩反應10 min 使沉淀溶解，用酶標儀于波長490 nm 處檢測吸光度（OD）值。細胞增殖抑制率＝1-OD 值實驗組／OD值空白對照組×100%。實驗重復3 次。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 各組細胞培養48 h后用預冷的PBS 漂洗2 次，與500 μL 的結合緩沖液混勻。先加入10 μL Annexin V-FITC，再加入5 μL PI，混勻后避光孵育10 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。每組設3 個復孔，實驗重復3 次。

1.5 Western blot 法檢測蛋白表達 各組細胞培養48 h 后提取總蛋白，定量后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，再加入一抗（1 ∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜；加入二抗（1 ∶2 000）室溫孵育90 min，TBST 洗滌，用ECL 發光液顯影，成像后用Quantity One 軟件檢測蛋白條帶灰度值，蛋白相對表達＝目的條帶灰度值／GAPDH 條帶灰度值。每個蛋白樣品設3 個重復。

1.6 RT-qPCR 檢測lncRNA AGAP2-AS1 和miR-646 的表達 各組細胞培養48 h，提取總RNA，反轉錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒使用說明進行PCR，每個樣品設3 個重復，循環條件為95 ℃3 min，95 ℃20 s，60 ℃30 s；72 ℃30 s，共40個循環；60 ℃延長5 min。相對表達量用2-△△Ct法計算。lncRNA AGAP2-AS1 和 miR-646 分別以GAPDH和U6 為內參，lncRNA AGAP2-AS1 正向引物序列5′-TACCTTGACCTTGCTGCTCTC-3′，反向引物 序 列5′-TGTCCCTTAATGACCCCATCC-3′；GAPDH 正向引物序列5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，反向引物序列 5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；miR-646 正向引物序列5′-ACACTCCAGCTGGGAAGCAGCTGCCTC-3′，反向引物序列5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGG CCTCAGA-3′；U6 正向引物序列5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物序列 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.7 熒光素酶報告實驗檢測lncRNA AGAP2-AS1對miR-646 的靶向調控 構建含miR-646 結合位點的野生型和突變型基因靶點lncRNA AGAP2-AS1 的熒光素酶表達載體 WT-AGAP2-AS1 和 MUTAGAP2-AS1，將其分別與miR-NC 和miR-646 共轉染至HCT116 細胞中。按照說明書檢測熒光素酶活性，實驗重復3 次。

1.8 統計學分析 采用SPSS 20.0 軟件進行處理，計量資料以（）表示，2 組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 蒺藜皂苷對結腸癌HCT116 細胞增殖和凋亡的影響 與對照組比較，蒺藜皂苷低、中、高劑量組HCT116 細胞增殖抑制率、細胞凋亡率及p21、Bax表達升高（P＜0.05），CyclinD1、Bcl-2 蛋白表達降低（P＜0.05），并呈濃度依賴性，見圖1、表1。

圖1 蒺藜皂苷對結腸癌HCT116 細胞增殖和凋亡的影響Fig.1 Effects of T.terrestris saponins on the proliferation and apoptosis of colon cancer HCT116 cells

表1 蒺藜皂苷對結腸癌HCT116 細胞增殖和凋亡的影響（，n＝9）Tab.1 Effects of T.terrestris saponins on the proliferation and apoptosis of colon cancer HCT116 cells（，n＝9）

表1 蒺藜皂苷對結腸癌HCT116 細胞增殖和凋亡的影響（，n＝9）Tab.1 Effects of T.terrestris saponins on the proliferation and apoptosis of colon cancer HCT116 cells（，n＝9）

注：與對照組比較，?P＜0.05；與蒺藜皂苷低劑量組比較，＃P＜0.05；與蒺藜皂苷中劑量組比較，△P＜0.05。

2.2 蒺藜皂苷對結腸癌HCT116 細胞中lncRNA AGAP2-AS1 和miR-646 表達的影響 與對照組比較，蒺藜皂苷低、中、高劑量組HCT116 細胞中lncRNA AGAP2-AS1 表達降低（P ＜0.05），miR-646 表達升高，并呈濃度依賴性（P ＜0.05），見表2。

表2 蒺藜皂苷對結腸癌HCT116 細胞中lncRNA AGAP2-AS1、miR-646 表達的影響（，n＝9）Tab.2 Effects of T.terrestris saponins on lncRNA AGAP2-AS1 and miR-646 expression in colon cancer HCT116 cells（，n＝9）

表2 蒺藜皂苷對結腸癌HCT116 細胞中lncRNA AGAP2-AS1、miR-646 表達的影響（，n＝9）Tab.2 Effects of T.terrestris saponins on lncRNA AGAP2-AS1 and miR-646 expression in colon cancer HCT116 cells（，n＝9）

注：與對照組比較，?P＜0.05；與蒺藜皂苷低劑量組比較，＃P＜0.05；與蒺藜皂苷中劑量組比較，△P＜0.05。

2.3 lncRNA AGAP2-AS1 靶向調控miR-646 表達 LncBase Predicted v.2 預測顯示，AGAP2-AS1與miR-646 存在結合位點，見圖2。熒光素酶報告實驗顯示，與miR-NC 組比較，miR-646 組中轉染WT-AGAP2-AS1 的細胞熒光素酶活性降低（P ＜0.05），而轉染MUT-AGAP2-AS1 的細胞熒光素酶活性無顯著差異，見表3。與pcDNA 組比較，pcDNA-AGAP2-AS1 組miR-646 表達降低（P ＜0.05）；與si-NC 組比較，si-AGAP2-AS1 組miR-646 表達升高（P＜0.05），見表4。

圖2 AGAP2-AS1 的序列中含有與miR-646 互補的核苷酸序列Fig.2 AGAP2-AS1 sequence containing a nucleotide sequence complementary to miR-646

表3 雙熒光素酶報告實驗結果（，n＝9）Tab.3 Results of double luciferase reporter assays（，n＝9）

表3 雙熒光素酶報告實驗結果（，n＝9）Tab.3 Results of double luciferase reporter assays（，n＝9）

注：與miR-NC 組比較，?P＜0.05。

表4 lncRNA AGAP2-AS1 調控miR-646 表達（，n＝9）Tab.4 Expression of miR-646 regulated by lncRNA AGAP2-AS1（，n＝9）

表4 lncRNA AGAP2-AS1 調控miR-646 表達（，n＝9）Tab.4 Expression of miR-646 regulated by lncRNA AGAP2-AS1（，n＝9）

注：與pcDNA 組比較，?P＜0.05；與si-NC 組比較，＃P＜0.05。

2.4 抑制lncRNA AGAP2-AS1 表達對結腸癌HCT116 細胞增殖和凋亡的影響 與si-NC 組比較，si-AGAP2-AS1 組HCT116 細胞AGAP2-AS1 表達及CyclinD1、Bcl-2 蛋白表達降低（P＜0.05），細胞增殖抑制率、細胞凋亡率及p21、Bax 表達升高（P＜0.05），見圖3、表5。

表5 抑制lncRNA AGAP2-AS1 表達對結腸癌HCT116 細胞增殖和凋亡的影響（，n＝9）Tab.5 Effects of lncRNA AGAP2-AS1 expression inhibition on colon cancer HCT116 cell proliferation and apoptosis（，n＝9）

表5 抑制lncRNA AGAP2-AS1 表達對結腸癌HCT116 細胞增殖和凋亡的影響（，n＝9）Tab.5 Effects of lncRNA AGAP2-AS1 expression inhibition on colon cancer HCT116 cell proliferation and apoptosis（，n＝9）

注：與si-NC 組比較，?P＜0.05。

2.5 miR-646 過表達對結腸癌HCT116 細胞增殖和凋亡的影響 與miR-NC 組比較，miR-646 組HCT116 細胞中miR-646 表達、細胞增殖抑制率、細胞凋亡率及p21、Bax 表達升高（P＜0.05），CyclinD1、Bcl-2 蛋白表達降低（P＜0.05），見圖4、表6。

圖3 抑制lncRNA AGAP2-AS1 表達對結腸癌HCT116 細胞增殖和凋亡的影響Fig.3 Effects of lncRNA AGAP2-AS1 expression inhibition on the proliferation and apoptosis of colon cancer HCT116 cells

圖4 miR-646 過表達對結腸癌HCT116 細胞增殖和凋亡的影響Fig.4 Effects of miR-646 overexpression on colon cancer HCT116 cell proliferation and apoptosis

表6 miR-646 過表達對結腸癌HCT116 細胞增殖和凋亡的影響（，n＝9）Tab.6 Effects of miR-646 overexpression on colon cancer HCT116 cell proliferation and apoptosis（，n＝9）

表6 miR-646 過表達對結腸癌HCT116 細胞增殖和凋亡的影響（，n＝9）Tab.6 Effects of miR-646 overexpression on colon cancer HCT116 cell proliferation and apoptosis（，n＝9）

注：與miR-NC 組比較，?P＜0.05。

2.6 lncRNA AGAP2-AS1 過表達逆轉了蒺藜皂苷對結腸癌HCT116 細胞增殖和凋亡的作用 與蒺藜皂苷+pcDNA 組比較，蒺藜皂苷+pcDNA-AGAP2-AS1 組 HCT116 細胞中 AGAP2-AS1 表達及CyclinD1、Bcl-2 蛋白表達升高（P ＜0.05），miR-646 表達、細胞增殖抑制率、細胞凋亡率及p21、Bax 表達降低（P＜0.05），見圖5、表7。

表7 lncRNA AGAP2-AS1 過表達逆轉了蒺藜皂苷對結腸癌HCT116 細胞增殖和凋亡的作用（，n＝9）Tab.7 Counteractive effect of T.terrestris saponins to lncRNA AGAP2-AS1 overexpression on colon cancer HCT116 cell proliferation and apoptosis（，n＝9）

表7 lncRNA AGAP2-AS1 過表達逆轉了蒺藜皂苷對結腸癌HCT116 細胞增殖和凋亡的作用（，n＝9）Tab.7 Counteractive effect of T.terrestris saponins to lncRNA AGAP2-AS1 overexpression on colon cancer HCT116 cell proliferation and apoptosis（，n＝9）

注：與對照組比較，?P＜0.05；與蒺藜皂苷+pcDNA 組比較，＃P＜0.05。

3 討論

圖5 lncRNA AGAP2-AS1 過表達逆轉了蒺藜皂苷對結腸癌HCT116 細胞增殖和凋亡的作用Fig.5 Counteractive effect of T.terrestris saponins to lncRNA AGAP2-AS1 overexpression on colon cancer HCT116 cell proliferation and apoptosis

細胞增殖和凋亡失衡是導致腫瘤發生的原因之一，尋找高效低毒的抗腫瘤藥物是腫瘤治療的研究熱點，而中藥天然活性成分逐漸成為現代抗腫瘤藥物開發的新趨勢［9］。蒺藜皂苷是中藥蒺藜的主要活性成分之一，研究表明蒺藜皂苷提取物可影響乳腺癌細胞的凋亡和轉移［10］。蒺藜皂苷D 在體外和體內可抑制人前列腺癌的生長和血管生成［11］。為研究蒺藜皂苷對結腸癌增殖、凋亡的影響，本實驗用不同濃度的蒺藜皂苷處理結腸癌HCT116 細胞，結果顯示，細胞增殖抑制率升高，細胞凋亡率升高，細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、B 細胞淋巴瘤／白血病-2（B cell lymphoma／leukemia-2，Bcl-2）蛋白表達降低，細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（Cyclin-dependent kinase inhibitor1A，p21）、Bcl-2 相關X（Bcl-2 associated X，Bax）表達升高，并呈濃度依賴性。表明蒺藜皂苷可劑量依賴的抑制結腸癌HCT116 細胞增殖、促進細胞凋亡。

研究報道miR-646 在胃癌組織中低表達，上調其表達抑制胃癌細胞的增殖和轉移［12］。過表達miR-646 可抑制肺癌A549 細胞的增殖、遷移及侵襲能力［13］。以上研究結果表明miR-646 在多種腫瘤中可能起抑癌作用。本實驗過表達miR-646 后可抑制結腸癌細胞增殖并誘導細胞凋亡。有研究報道lncRNA ZFAS1 可通過下調miR-646 促進骨肉瘤細胞的生長，遷移和侵襲［14］。

研究報道AGAP2-AS1 可促進肝細胞癌細胞增殖、遷移、侵襲，并抑制細胞凋亡［15］。AGAP2-AS1 上調還可促進胰腺癌細胞增殖和遷移［16］。沉默AGAP2-AS1 抑制食道癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡［17］。本實驗結果顯示，抑制lncRNA AGAP2-AS1 表達，細胞增殖抑制率升高，細胞凋亡率升高，CyclinD1、Bcl-2 蛋白表達降低，p21、Bax 表達升高。表明抑制lncRNA AGAP2-AS1表達可抑制結腸癌HCT116 細胞增殖、促進細胞凋亡。且本實驗還發現，AGAP2-AS1 靶向調控miR-646。蒺藜皂苷處理后結腸癌HCT116 細胞中AGAP2-AS1 表達降低，miR-646 表達升高；且lncRNA AGAP2-AS1 過表達逆轉了蒺藜皂苷對結腸癌HCT116 細胞增殖和凋亡的作用。表明蒺藜皂苷可能通過下調抑制結腸癌HCT116 細胞增殖、促進細胞凋亡。

綜上所述，蒺藜皂苷可通過調控lncRNA AGAP2-AS1／miR-646 表達抑制結腸癌細胞的增殖、誘導細胞凋亡。