降香不同提取物通過調(diào)控能量代謝抑制大鼠急性心肌缺血損傷

壽斌耀 ，陳蘭英? ，張 妮，謝欣序，羅穎穎，邵 峰，劉榮華

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，江西南昌 330006；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西南昌 330004）

降香Dalbergia odorifera T.Chen，為豆科植物降香檀樹干和根的干燥心材，具有行氣止痛、化瘀止血的功效［1］。其成分復(fù)雜，主要含有揮發(fā)油、黃酮類。現(xiàn)代研究表明降香具有抗氧化、抗炎、抗血小板聚集等多種作用［2］。臨床上降香被廣泛用于心血管疾病的治療。然而，降香在心血管方面的作用及機(jī)制仍不明確。本研究以降香中醫(yī)功效行氣止痛為起點(diǎn)，探索降香的藥理作用與機(jī)制。行氣是指進(jìn)入心臟的氣（氧氣和水谷精微），產(chǎn)生ATP，進(jìn)而維持心肌正常結(jié)構(gòu)與功能［3］，其與能量代謝密切相關(guān)。同時(shí)研究報(bào)道指出降香油（volatile oil of D.odorifera，DOO）、降香水提物（aqueous extract of D.odorifera，DOA）具有調(diào)節(jié)心臟正常能量代謝的作用［4］。基于此，為進(jìn)一步研究降香水提物與降香油對(duì)心臟的影響，實(shí)驗(yàn)構(gòu)建異丙腎上腺素誘導(dǎo)的急性心肌缺血模型，探究降香水提物和降香油對(duì)缺血大鼠心臟能量代謝的影響及可能機(jī)制，以期為降香的臨床使用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2019-0004。

1.2 試劑與藥物 實(shí)驗(yàn)用降香藥材購(gòu)于廣西玉林東盟藥材市場(chǎng)，由廣西大學(xué)林產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心檢測(cè)鑒定。降香水提物（自制）和降香油（自制），均由江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉榮華教授團(tuán)隊(duì)提供。降香水提物的制備（降香藥材陰干粉碎后1 kg，加10 L 水提取1 h，濾過。濾渣用8 L 水再提取1 h，濾過，合并濾液，濃縮干燥，得到干浸膏，得干浸膏93.8 g，得膏率9.38%）。降香油的制備（降香藥材1 kg，水蒸氣蒸餾法回流提取6 h。收集餾出液，通過分液處理得到油性成分，得到降香油21.5 g，得油率2.15%）；異丙腎上腺素（批號(hào)WXBB7695V，美國(guó)Sigma 公司）；鹽酸普萘洛爾片（批號(hào)E180913，江蘇亞邦愛普森藥業(yè)有限公司）；乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)定試劑盒（批號(hào) R1 AR796，R2 AP318）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）測(cè)定試劑盒（批號(hào)R1 AR792，R2 TG862），均購(gòu)于日本和光純藥株式會(huì)社；肌酸激酶同工酶MB（CKMB）測(cè)定試劑盒（批號(hào)18111001，北京利德曼生化股份有限公司）；蘇木精及伊紅染液（批號(hào)517-28-2，美國(guó)Sigma 公司）；三磷酸腺苷二鈉（批號(hào)140674-201502）、一磷酸腺苷鈉（批號(hào)140719-200501）、二磷酸腺苷二鈉（批號(hào)140809-201501），均購(gòu)自于中國(guó)食品藥品檢定研究院；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)K1622）、SYBR Green mix 試劑盒（批號(hào)4472908），均購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher 公司。

1.3 儀器 Centrifuge5810R 高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；ABI750 型熒光定量PCR 儀（美國(guó)ABI 公司）；ML204E 分析天平（瑞士Mettler Tiledo 公司）；亞光YB-6LF 型生物組織石蠟包埋機(jī)（孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；日立7100全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）；常壓高效液相色譜儀（日本島津公司）；ML866 型Powerlab 電生理記錄儀（澳大利亞ADI Instruments 公司）；RM2016 型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物造模及給藥 取健康大鼠70 只，適應(yīng)環(huán)境后按體質(zhì)重隨機(jī)分成7 組，分別為正常組（給予等容量蒸餾水），模型組（給予等容量蒸餾水），普萘洛爾（30 mg／kg），降香水提物高劑量組（320 mg／kg）、降香水提物低劑量組（160 mg／kg），降香油高劑量組（72 mg／kg）、降香油低劑量組（36 mg／kg）。連續(xù)灌胃給藥5 d。根據(jù)文獻(xiàn)［5］方法以及實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)造模劑量的摸索，第4 天、第5 天，灌胃給藥30 min 后，除正常組外，其余各組皮下注射異丙腎上腺素30 mg／kg，每天1 次，連續(xù)注射2 d，復(fù)制急性心肌缺血模型。正常組皮下注射等體積的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)水，進(jìn)食。

2.2 大鼠心電圖測(cè)定 末次給藥40 min 后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，仰臥固定，Powerlab電生理記錄儀記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖10 min。在皮下注射異丙腎上腺素或者生理鹽水后繼續(xù)觀察30 min，比較各組大鼠造模前后的ST 段差值。

2.3 大鼠血壓的測(cè)定 心電圖檢測(cè)完畢后，自大鼠頸部正中切開，促使大鼠左頸總動(dòng)脈充分暴露，并對(duì)其進(jìn)行鈍性分離，將頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端結(jié)扎，近心端用動(dòng)脈夾夾住，將準(zhǔn)備好的頸動(dòng)脈插管向近心端插入，用近心端的穿線結(jié)扎動(dòng)脈血管和導(dǎo)管，即可看到動(dòng)脈的血壓波形，等動(dòng)物穩(wěn)定后，就開始實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。測(cè)得收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓。

2.4 血清心肌酶LDH、CK-MB、AST 檢測(cè) 血壓檢測(cè)后，每只大鼠立即腹主動(dòng)脈采血，室溫靜置1 h后低溫高速離心機(jī)以3 500 r／min 離心10 min，分離血清。全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清LDH、CKMB、AST 水平。

2.5 心肌組織病理學(xué)觀察 取心臟組織，10%甲醛固定24 h 以上，然后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，切片（5 μm），HE 染色，封片最后在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理變化。

2.6 HPLC 檢測(cè)心臟組織高能磷酸化合物含量按照文獻(xiàn)方法對(duì)心臟組織進(jìn)行處理［6］，制備樣本。ODSHYPERSILC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫25 ℃；流動(dòng)相50 mmol／L 的磷酸鉀緩沖液（pH 6.5）；體積流量1 mL／min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量10 μL。根據(jù)以上檢測(cè)條件，測(cè)定心肌組織中ATP、ADP 和AMP 含量，其中總腺苷酸量TAN＝ATP+ADP+AMP；心肌細(xì)胞能荷EC ＝（ATP+1／2ADP）／TAN。

2.7 RT-PCR 法檢測(cè)心臟組織AMPK 相關(guān)基因的表達(dá) 取心臟組織按照trizol 試劑盒說明書提取RNA，測(cè)定RNA 的濃度，在總體積20 μL 的條件下逆轉(zhuǎn)錄RNA 得到cDNA。進(jìn)行Real-time PCR。引物序列為VEGF（正向：CGGTGTGGTCTTTCGTCCTTC，反向：GGTTTGTCGTGTTTCTGGAAGTG ）；ENOS（正 向：GATGGCTGAACGAAGATTGC，反向：TATTTGATGCTCGGGACTGC）；β-actin（正向：ACAGTGGAGAACTGTGAGCA，反向：CTGCTCCCGGTTAGAGTAGG ）；AMPK（正向：TTGAAACCTGAAAATGTCCTGCT，反向：GGTGAGCCACAACTTGTTCTT）；CPT1（正向：TATGGTCAAGGTCCTCTCAGGT，反向：GAAGACGAATGGGTTTGAGTTC）；GLUT4（正向：ACTCAGGGCTAACATCAGGGT，反向：CTCAGGACAGAAGGGCAACAG）；PFKFB3（正向：AGCTGACTCGCTACCTCAAC，反向：GCCCACCATGACGATGACGG）；PKM2（正向：TTCCTGCCTCTTGGTATGAC，反向：CGGCTTGTTCCCTCCTAC）；PDH（正向：CCATCTCATCACTGCCTATCG，反向：AGCCTCCTCTTCGTCCTGTTA）；PI3K（正向：AACGACAAGCAGAAGT，反 向：CGAGGACAGCAACAT）。反應(yīng)條件按照ThermoFisher Real-time PCR 試劑盒。基因表達(dá)計(jì)算由2-△△CT表示。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 通過SPSS 19.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比采用LSD 法。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)急性心肌缺血大鼠心電圖的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組ST 段變化值和心率升高（P ＜0.01），顯示心肌缺血；與模型組比較，降香各提取物組與普萘洛爾能顯著ST 段變化值（P＜0.01，P＜0.05）；降香油組能降低大鼠心率（P＜0.01）。見表1。

表1 降香水提取和降香油對(duì)急性心肌缺血大鼠心電圖ST段變化值與心率的影響（，n＝6）Tab.1 Effects of DOA and DOO on ECG ST segment changes and heart rate in rats with acute myocardial ischemia（，n＝6）

表1 降香水提取和降香油對(duì)急性心肌缺血大鼠心電圖ST段變化值與心率的影響（，n＝6）Tab.1 Effects of DOA and DOO on ECG ST segment changes and heart rate in rats with acute myocardial ischemia（，n＝6）

注：與正常組比較，??P ＜0.01；與模型組比較，＃ P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 對(duì)急性心肌大鼠血壓的影響 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的收縮壓、舒張壓均低于正常大鼠的收縮壓、舒張壓（P＜0.01）。給予降香油處理，大鼠收縮壓、舒張壓對(duì)比模型組有所恢復(fù)；普萘洛爾組和降香水提物組，大鼠收縮壓、舒張壓對(duì)比模型組無差異。見表2。

表2 降香水提物和降香油對(duì)急性心肌缺血大鼠收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓的影響（，n＝6，1 mmHg＝0.133 3 kPa）Tab.2 Effects of DOA and DOO on systolic blood pressure，diastolic blood pressure and mean arterial pressure in rats with acute myocardial ischemia（，n＝6，1 mmHg＝0.133 3 kPa）

表2 降香水提物和降香油對(duì)急性心肌缺血大鼠收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓的影響（，n＝6，1 mmHg＝0.133 3 kPa）Tab.2 Effects of DOA and DOO on systolic blood pressure，diastolic blood pressure and mean arterial pressure in rats with acute myocardial ischemia（，n＝6，1 mmHg＝0.133 3 kPa）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.3 對(duì)血清LDH、CK-MB、AST 水平的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清LDH、CK-MB、AST 水平升高（P＜0.01）。與模型組比較，除了降香水提物低劑量組外其余各組都能降低血清LDH、CK-MB、AST 水平（P＜0.05，P＜0.01）；降香水提物低劑量組能降低血清CK-MB、AST 水平（P＜0.05）。見表3。

3.4 對(duì)組織病理學(xué)的影響 HE 染色結(jié)果顯示，正常組大鼠心肌纖維排列整齊，細(xì)胞核形態(tài)正常，未出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等情況。模型組大鼠心肌損傷明顯、心肌纖維斷裂、排列紊亂、空泡化明顯、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。普萘洛爾組心肌纖維排列整齊，細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。降香油高劑量組與降香油低劑量組大鼠心肌纖維輕度排列紊亂，局部少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。降香水提物高劑量組大鼠心肌纖維中度紊亂，輕中度空泡樣變性，輕度水腫，間質(zhì)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。降香水提物低劑量組大鼠心肌纖維斷裂，細(xì)胞空泡變性明顯，間質(zhì)有明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖1。

表3 降香水提物和降香油對(duì)急性心肌缺血大鼠血清LDH、CK-MB、AST 水平的影響（，n＝10）Tab.3 Effects of DOA and DOO on serum LDH，CK-MB and AST levels in rats with acute myocardial ischemia（，n＝10）

表3 降香水提物和降香油對(duì)急性心肌缺血大鼠血清LDH、CK-MB、AST 水平的影響（，n＝10）Tab.3 Effects of DOA and DOO on serum LDH，CK-MB and AST levels in rats with acute myocardial ischemia（，n＝10）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.5 對(duì)心臟組織高能磷酸化合物及能荷的影響 在本實(shí)驗(yàn)中，ATP、ADP、AMP 在10 min 內(nèi)達(dá)到基線分離，保留時(shí)間為3.259、3.510、4.314 min。見圖2。與正常組比較，模型組心肌組織高能磷酸化合物含量和細(xì)胞能荷EC 水平下降（P＜0.01）；與模型組比較，普萘洛爾組能夠明顯改善心肌能量代謝，心肌組織ATP 含量和能荷EC 水平提升（P＜0.01）。降香水提物和降香油各組在ATP、ADP、AMP 水平?jīng)]有明顯改善，在能荷EC 水平上提升（P＜0.01）。見表4。

圖2 心肌提取液樣本與ATP、ADP、AMP 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.2 Chromatograms of myocardial extract samples and ATP，ADP，AMP standards

表4 降香水提物和降香油對(duì)心臟組織ATP、ADP、AMP 及能荷EC 的影響（，n＝6）Tab.4 Effects of DOA and DOO on cardiac tissue ATP，ADP，AMP and energy charge（，n＝6）

表4 降香水提物和降香油對(duì)心臟組織ATP、ADP、AMP 及能荷EC 的影響（，n＝6）Tab.4 Effects of DOA and DOO on cardiac tissue ATP，ADP，AMP and energy charge（，n＝6）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.6 對(duì)心臟組織VEGF、 ENOS、 CPT1、 AMPK、GLUT4、 PFKFB3、 PKM2、 PDH、 PI3K mRNA 水平的影響 與正常組比較，模型組AMPK、 CPT1、PI3K、 VEGF mRNA 表達(dá)降低（P ＜0.05，P ＜0.01），PFKFB3、 PKM2 mRNA 表達(dá)上升高（P ＜0.01），ENOS mRNA 表達(dá)有降低趨勢(shì)；與模型組比較，降香水提物各組PFKFB3、 PKM2 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01），PI3K、 ENOS、 VEGF mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01），高低劑量組存在量效關(guān)系。降香油各組AMPK、 CPT1mRNA 顯著升高（P ＜0.01），高劑量組表達(dá)更顯著。見圖3。

4 討論

圖3 降香水提物和降香油對(duì)VEGF、 ENOS、 CPT1、 AMPK、 GLUT4、 PFKFB3、 PKM2、 PDH、 PI3K mRNA 表達(dá)的影響Fig.3 Effects of DOA and DOO on VEGF，ENOS，CPT1，AMPK，GLUT4，PFKFB3，PKM2，PDH，PI3K mRNA expressions

脂質(zhì)代謝、糖代謝是心肌細(xì)胞維持正常能量代謝的主要途徑。其中脂肪酸是心臟的主要能量來源，約60%～70%的三磷酸腺苷（ATP）是由脂肪酸通過脂肪酸β 氧化產(chǎn)生。在整個(gè)脂肪酸β 氧化中脂酰CoA 進(jìn)入線粒體是脂肪酸氧化的限速步驟，CPT-1 蛋白位于線粒體外膜是脂肪酸氧化的限速酶［7-8］。葡萄糖是心臟代謝的另一種重要底物，葡萄糖代謝是一種高效率的能量代謝方式。通過糖酵解產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進(jìn)入線粒體后在丙酮酸脫氫酶（PDH）的作用下不可逆的轉(zhuǎn)化為乙酰CoA 和NADH，PDH 是葡萄糖氧化過程中的關(guān)鍵酶。心肌缺血，心肌細(xì)胞氧氣供應(yīng)減少，能量代謝改變，主要表現(xiàn)為脂肪酸與葡萄糖氧化的變化［9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明異丙腎上腺素造模后，模型組心臟組織ATP、ADP、AMP 整體下降，心肌細(xì)胞能量狀態(tài)EC 水平明顯降低。普萘洛爾組心臟組織ATP 含量較模型組顯著上升，心肌細(xì)胞能量狀態(tài)EC 水平明顯提升。降香水提物與降香油組ATP、ADP、AMP、TAN 與模型組比較并無差異，但是心肌細(xì)胞能荷EC 水平卻明顯升高，表明了降香水提物與降香油能夠在低能量水平維持正常的心肌細(xì)胞能荷EC。另外，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也表示降香水提物組能夠抑制葡萄糖有氧代謝的關(guān)鍵酶PDH 的表達(dá)，增強(qiáng)VEGF、 PI3K、 ENOS 基因的表達(dá)；VEGF 是多方位影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的生產(chǎn)因子，其介導(dǎo)血管新生是微細(xì)血管增殖、新生血管形成的關(guān)鍵因素［10］。降香油能夠增強(qiáng)AMPK 基因的表達(dá)。腺苷酸激活蛋白激酶AMPK 是CPT1 的正向基因，能夠調(diào)節(jié)多種脂質(zhì)代謝相關(guān)酶及轉(zhuǎn)錄因子，在維持脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著極其重要的作用［11］。實(shí)驗(yàn)表明降香水提物和降香油能夠調(diào)節(jié)脂肪酸氧化與糖代謝，維持心肌細(xì)胞能量代謝的平衡，從而起到保護(hù)心肌的作用。

在本研究中，課題組發(fā)現(xiàn)降香抑制糖代謝，增強(qiáng)脂肪酸氧化調(diào)控心肌能量代謝平衡，保護(hù)心臟的作用這一機(jī)制與市場(chǎng)上的一些藥物如曲美他嗪、哌克昔林通過抑制脂肪酸氧化，增強(qiáng)糖代謝發(fā)揮心肌保護(hù)作用的機(jī)制相反；與正常心臟能量代謝中脂肪酸氧化占比高于糖代謝這一情況相同。分析其可能原因?yàn)閺?qiáng)糖代謝、抑制脂肪酸氧化，能夠用更少的氧氣提供更多的能量［12］，能夠緩解心肌缺血心臟能量供需不平。而增強(qiáng)脂肪酸氧化、抑制糖代謝，更有利于維持心臟的正常能量代謝，在治療心絞痛，預(yù)防心肌缺血上發(fā)揮更大的作用。

實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示降香水提物和降香油對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠急性心肌缺血模型具有保護(hù)作用，可以明顯降低心電圖ST 段變化，降低血清心肌酶CK-MB、LDH 及AST 的水平，減輕心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷。進(jìn)一步的機(jī)制研究結(jié)果顯示，降香油主要是通過上調(diào)AMPK、CPT1 增強(qiáng)脂肪酸氧化維持能量代謝平衡，降香水提物主要通過抑制PKM2、PFKFB3 抑制糖酵解途徑來維持能量代謝平衡。