淡黃裂孔菌和硫色小木層孔菌發酵液化學成分的研究

王 雙，字洪芳

（大理大學藥學院，云南大理 671000）

淡黃裂孔菌Schizopora flavipora（Berk.＆ M.A.Curtis ex Cooke）Ryvarden（syn. Poria flavipora）和硫色小木層孔菌Phellinidium sulphurascens（Pilát）Y.C.Dai（syn. Coniferiporia sulphurascens）均為嚴重的森林病原菌，常生長在針葉樹上，可引起木材的白色腐朽及森林大面積死亡［1-3］。淡黃裂孔菌和硫色小木層孔菌均為銹革孔菌目真菌，前者隸屬于裂孔菌科、裂孔菌屬［4］，后者隸屬于銹革孔菌科、小木層孔屬［5］。

目前對2 種真菌化學成分的研究較少，硫色小木層孔菌中主要含有血莧烷型倍半萜［6］。本課題組在尋找高等真菌中活性成分的過程中［7-8］，對這2種白色腐朽真菌的發酵液進行化學成分初探，從淡黃裂孔菌中分離得到了2 個氧雜蒽酮類化合物，其中化合物1 為新化合物。從硫色小木層孔菌中分離得到了異地花菌素和2 個血莧烷型倍半萜化合物。

在深入研究云南高等真菌的代謝產物過程中，為尋找更多的結構新穎和具良好活性的先導化合物，OSMAC 是一種有效的策略［9］。OSMAC 策略強調通過改變培養基成分、培養條件和添加酶抑制劑等干擾因素來刺激微生物，激活不同的合成基因簇，挖掘其產生不同次級代謝產物的能力，從而獲得骨架新穎、活性高的新化合物。本研究在OSMAC 策略指導下對淡黃裂孔菌和硫色小木層孔菌2 個較稀有高等真菌進行次級代謝產物初步探索，從中分別得到了氧雜蒽酮類、地花菌素類和血莧烷型倍半萜類，氧雜蒽酮類化合物可與不同的靶標作用而具有廣泛的生物活性，曾被藥物化學家稱為“特權結構”［10］；地花菌素類化合物則因其抗癌活性、抗HIV 活性而備受關注［11-12］；部分血莧烷型倍半萜化合物則具抗真菌作用［13］或對植物病原菌的孢子萌發有顯著抑制活性［14］。根據OSMAC策略原理，此次初步研究結果提示這2 種高等真菌具有潛在的合成基因簇、值得更深入地挖掘。在后期研究中可通過擴大發酵液培養規模、改變培養基成分和培養條件等措施而獲得更多活性分子。

1 材料

Bruker DRX-500 和AM-400 型核磁共振譜儀（TMS 為內標，德國Bruker 公司）；液相四級桿飛行時間質譜儀（美國領先仿生有限公司）；Agilent 1200 HPLC、Agilent Zorbox SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）（美國安捷倫公司）；制備柱Zorbax SB-C18（21.2 mm × 150 mm，5 μm）；Sephadex LH-20 凝膠（瑞典Amersham Biosciences公司）；RP-18 反相硅膠Chromatorex（40～75 μm，日本Fuji 公司）；正相硅膠（80～100、200～300目）、GF254TLC 板（青島海洋化工廠）。

顯色方法為熒光燈254、365 nm 波長下觀察熒光，碘蒸氣顯色，10% 濃硫酸香草醛處理后加熱顯色。

淡黃裂孔菌的子實體于2008 年采自湖北省神農架，硫色小木層孔菌的子實體于2009 年采自吉林省安圖縣長白山自然保護區，兩者均由中國科學院昆明植物研究所楊祝良研究員鑒定為正品。

2 培養與發酵

2 種真菌的發酵均采用斜面轉三角瓶液體培養的方法。培養基為葡萄糖20 g、去皮土豆200 g、MgSO41.5 g、KH2PO43 g、VB110 mg，加水混合攪拌至1 000 mL。500 mL 三角瓶裝300 mL 液體培養基，接種量為10%，25 ℃下150 r／min 搖床上培養25 d。

3 提取與分離

淡黃裂孔菌發酵液（20 L）濾除菌絲體后濃縮至5 L，用乙酸乙酯萃取3 次，合并提取液蒸干得浸膏15.5 g。然后，經正相硅膠柱色譜（200～300目）、石油醚-丙酮（9 ∶1～1 ∶1）梯度洗脫，按香草醛濃硫酸等顯色結果合并得到6 個組分（A～G）。其中組分C 經Sephadex LH-20 氯仿-甲醇（1 ∶1）、正相硅膠色譜柱石油醚-乙酸乙酯（9 ∶1～3 ∶1）梯度洗脫，再經制備HPLC 乙腈-水（30%～60%）梯度洗脫得到化合物1（2.3 mg）、2（2.4 mg）。

硫色小木層孔菌發酵液（21 L）濾除菌絲體后濃縮至5 L，用乙酸乙酯萃取3 次，合并提取液蒸干得浸膏42.5 g。然后，經正相硅膠柱色譜（200～300 目）、石油醚-丙酮（9 ∶1～1 ∶1）梯度洗脫，按香草醛濃硫酸等顯色結果合并得到6 個組分（A～G）。組分C 經Sephadex LH-20 氯仿-甲醇（1 ∶1）、正相硅膠氯仿-乙酸乙酯（20 ∶1～5 ∶1）梯度洗脫、常壓反相硅膠柱甲醇-水（40%～90%）梯度洗脫、制備HPLC 乙腈-水（40%～70%）梯度洗脫得化合物4（3.2 mg）、5（2.4 mg）；組分D石油醚-丙酮（4 ∶1）經硅膠柱氯仿-乙酸乙酯（20 ∶1～4 ∶1）、Sephadex LH-20 氯仿-甲醇（1 ∶1）和制備HPLC 乙腈-水（35%～65%）梯度洗脫得化合物3（4.1 mg）。

4 結構鑒定

化合物1：黃色粉末。通過高分辨質譜HRESI-MS m／z：279.063 3，分子式C15H12O4，不飽和度為10。從13C-NMR 譜中（表1）可見15 個碳信號，由DEPT 譜可知其中有2 個甲基（其中1個連氧）、5 個次甲基、8 個季碳（包括1 個共軛羰基）；1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）進一步確定了甲氧基、甲基及羥基（9.88，1H，brs）的存在，除此之外只余5 個芳香氫信號，結合飽和度和碳譜信息，猜測結構母核可能為雜氧蒽酮［15］。從1HNMR 譜中δ 7.39（1H，d，J ＝2.0 Hz，H-8），7.36（1H，d，J ＝8.0 Hz，H-5），7.19（1H，dd，J ＝8.0，2.0 Hz，H-6）信號特別是峰形可知，該苯環為1，2，5 三取代，另外2 個氫信號6.89（1H，s H-4），6.76（1H，s，H-2）所在苯環為1，2，3，5 四取代，2 個氫為間位取代。根據HSQC 信號可知H-1′（3.85，3H，s）與C-1′（56.0，q）相連、H-3′（2.39，3H，s）與C-3′（21.9，q）相連、H-2（6.76，1H，s）與C-2（109.5，d）相連、H-4（6.89，1H，s）與C-4（108.8，d）相連、H-5（7.36，1H，d，J ＝8.0 Hz）與C-5（123.0，d）相連、H-6（7.19，1H，dd，J ＝8.0，2.0 Hz）與C-6（123.3，d）相連、H-8（7.39，1H，d，J ＝2.0 Hz）與C-8（109.0，d）相連。根據HMBC 譜信號，羥甲基H-1′與C-1（160.0，s）關聯，甲基H-3′與C-3（146.5，s）、C-2（109.5，d）、C-4（108.8，d）關聯，H-2 與C-1（160.0，s）、C-3、C-9a（107.0，s）、C-3′（21.9，q）、C-4 關聯，H-4 與 C-4a（157.4，s）、C-3、C-3′、C-2 關聯，可知化合物1的1 位被羥甲基取代、3 位為甲基取代。根據HMBC 譜信號，H-5 與C-4b（147.9，s）、C-6、C-7（153.7，s）、C-8a（118.7，s）關聯，H-6 與C-5、C-7、C-4b、C-8 關聯，H-8 與C-7、C-8a、C-6、C-9（174.3，s）關聯，可知化合物1 的7 位被羥基取代。此外，化合物1 與已知化合物1，7-dihydroxymethylxanthone［16-17］區別盡在甲基取代，至此化合物1 的結構確定為1-methoxy-7-hydroxy-methylxanthone，為新化合物。

表1 化合物1 的NMR 數據（DMSO-d6）Tab.1 NMR spectral data of compound 1（DMSO-d6）

化合物2：黃色粉末，ESI-MS m／z：265.0［M+Na］+，分子式C14H10O4。1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6） δ：7.51（1H，d，J ＝2.0 Hz，H-8），7.41（1H，d，J ＝8.0 Hz，H-5），7.33（1H，dd，J ＝8.0，2.0 Hz，H-6），6.86（1H，d，J ＝2.0 Hz，H-4），6.62（1H，d，J ＝2.0 Hz，H-2），2.37（3H，s，H-3′）；13C-NMR（500 MHz，DMSO-d6） δ：181.4（s，C-9），160.9（s，C-1），156.1（s，C-4a），154.4（s，C-7），149.6（s，C-4b），149.3（s，C-3），125.7（d，C-6），120.8（d，C-5），119.7（s，C-8a），110.8（d，C-2），108.1（d，C-8），107.8（d，C-4），106.2（s，C-9a），22.4（q，C-3′）。以上數據與文獻［16-17］報道一致，故鑒定為1，7-dihydroxymethyl-xanthone。

圖1 化合物1 結構及其HMBC 相關圖Fig.1 Structures compounds 1 and its key HMBC correlations

化合物3：黃色油狀物；分子式C22H32O2；ESI-MS m／z：351.2 ［M+Na］+。1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：6.26（1H，d，J ＝2.3 Hz，H-1），6.21（1H，d，J ＝2.3 Hz，H-3），5.14（1H，t，J ＝6.7 Hz，H-2′），5.07（1H，m，H-6′），5.06（1H，m，H-10′），3.29（2H，d，J ＝6.7 Hz，H-1′），2.23（3H，s，H-8），2.09（2H，m，H-8′），2.04（2H，m，H-4′），2.03（2H，m，H-5′a，9′a），1.96（2H，m，H-5′b，H-9′b），1.79（3H，s，H-15′），1.67（3H，s，H-12′），1.59（3H，s，H-13′），1.58（3H，s，H-14′）；13C-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：155.4（s，C-4），154.2（s，C-6），138.4（s，C-3′），137.6（s，C-2），135.4（s，C-7′），131.2（s，C-11′），124.4（d，C-10′），123.6（d，C-6′），121.6（d，C-2′），110.4（s，C-5），109.0（d，C-1），101.0（d，C-3），39.6（t，C-4′），39.5（t，C-8′），26.6（t，C-5′），26.3（t，C-9′），25.6（q，C-12′），22.1（t，C-1′），21.0（q，C-8），17.6（q，C-13′），16.2（q，C-15′），16.0（q，C-14′）。以上數據與文獻［18-19］報道一致，故鑒定為異地花菌素。

化合物4：白色粉末；分子式15H26O2；ESI-MS m／z：261.2 ［M+Na］+。1H-NMR（500 MHz，CDCl3） δ：5.52（1H，brs，H-7），3.85（1H，dd，J ＝11.0，2.5 Hz，H-11a），3.74（1H，dd，J ＝10.8，7.2 Hz，H-11b），3.25（1H，dd，J ＝10.6，5.1 Hz，H-3），2.00（3H，m，H-1a，H-6），1.83（1H，m，H-9），1.64（2H，m，H-2），1.23（1H，m，H-1b），1.77（3H，s，H-12），1.18（1H，m，H-5），0.97（3H，s，H-15），0.85（3H，s，H-14），0.84（3H，s，H-13）；13C-NMR（500 MHz，CDCl3） δ：132.8（s，C-8），123.8（d，C-7），79.0（d，C-3），60.7（t，C-11），57.0（d，C-9），49.3（t，C-5），38.6（s，C-4），37.8（t，C-1），35.8（s，C-10），28.0（q，C-15），27.2（t，C-2），23.2（t，C-6），15.3（q，C-14），14.9（q，C-13）。以上數據與文獻［20-21］報道一致，故鑒定為7-drimene-3，11-diol。

化合物5：白色粉末；分子式C15H26O3，ESIMS m／z：277.2 ［M+Na］+。1H-NMR（500 MHz，CDCl3） δ：5.79（1H，brs，H-7），4.26（1H，d，J ＝12.8 Hz，H-12a），3.97（1H，d，J ＝12.8 Hz，H-12b），3.84（1H，dd，J ＝11.0，2.5 Hz，H-11a），3.63（1H，dd，J ＝10.8，7.2 Hz，H-11b），3.20（1H，dd，J ＝10.7，5.2 Hz，H-3），2.04（4H，m，H-1a，H-6，H-9），1.63（2H，m，H-2），1.31（1H，m，H-1b），1.24（1H，m，H-5），0.98（3H，s，H-15），0.88（3H，s，H-14），0.84（3H，s，H-13）；13C-NMR（500 MHz，CDCl3） δ：138.6（s，C-8），126.4（d，C-7），79.7（d，C-3），66.9（t，C-12），61.3（t，C-11），55.8（d，C-9），50.8（t，C-5），39.9（s，C-4），39.0（t，C-1），36.7（s，C-10），28.8（q，C-15），28.2（t，C-2），24.4（t，C-6），16.0（q，C-14），15.1（q，C-13）。以上數據與文獻［21-22］報道一致，故鑒定為7-drimene-3，11，12-triol。