HPLC 法同時測定小葉榕中4 種成分

王新雨，黃煒忠，張馮榮，滕云霞

（廣東羅浮山國藥股份有限公司，廣東惠州 516133）

小葉榕又名落地金錢，為桑科植物榕樹Ficus miconcinna MiqLf.的干燥嫩枝和葉。具有清熱發表、解毒消腫、祛濕止痛的功效。主治流感、慢性支氣管炎、扁桃體炎等癥［1］。主要含黃酮類、三萜類、甾醇類等成分［2-3］。藥理作用研究表明其具有清除自由基、抗炎、鎮痛、抗病毒、化痰止咳平喘等作用［4-6］。以小葉榕干浸膏為原料的咳特靈制劑，臨床上在治療咳嗽方面取得了良好的效果［7-8］。目前，法定標準中，小葉榕及其相關制劑的質量控制定量指標均為牡荊苷和異牡荊苷的總含量［1，9］，但該指標不能反映其多成分、多靶點的特點，難以全面反映藥材質量。文獻記載中同樣多為對牡荊苷和異牡荊苷2 種成分的含量進行測定［10］。徐勤等［11］用UPLC-QQQ-MS 測定了小葉榕中12 種成分的含量，但儀器成本較高，很難在企業中普及。而HPLC 法操作簡單、成本相對較低，容易推廣。因此，本研究采用UPLC-ESI-Orbitrap-MS 對其主要成分進行鑒定分析，并建立HPLC 法同時測定小葉榕中4 種成分的含量，以全面控制小葉榕藥材的質量，以期為小葉榕及含有小葉榕相關制劑的質量標準研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Orbitrap Fusion 超高分辨三合一質譜儀；Vanquish 超高效液相（美國Thermo Fisher公司）；KQ-300VDE 型雙頻數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AB135-S 電子天平（0.01 mg，瑞士梅特勒托利多公司）。

1.2 試劑 甲醇（科魯德化工股份有限公司，批號520602）；磷酸（天津市大茂化學試劑廠，批號20190901）；乙醇（西隴科學股份有限公司，批號1812201）；肉桂酸（批號110786-201604，質量分數98.8%）、異葒草苷（批號111974-201401，質量分數94.0%）、牡荊苷對照品（批號111687-201704，質量分數94.9%），均購于中國食品藥品檢定研究院；異牡荊苷對照品（上海鴻永生物科技有限公司，批號250215-201903，質量分數≥98%）。

1.3 原料 從廣州、惠州、佛山等地自購的小葉榕藥材6 批，經廣東羅浮山國藥股份有限公司廖志鐘主任中藥師鑒定，均為桑科植物榕樹Ficus miconcinna MiqLf.的干燥嫩枝和葉。批號按采集的先后順序編號，依次為2019071601G（佛山）、2019071602G（廣州）、2019071603G（廣州）、2019071604G（惠州）、2019071605G（廣州）、2019071606G（惠州）。

2 方法與結果

2.1 小葉榕主要成分分析

2.1.1 分析條件 采用Waters Acquity UPLC HSS T3 柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相0.1%甲酸水（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～16 min，5%～100% B；16～22 min，100% B）；體積流量0.3 mL／min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

2.1.2 質譜條件 離子源類型H-ESI；掃描范圍（m／z）100～1 000；正離子3 500 V；負離子2 500 V；離子轉移管溫度320 ℃；汽化器溫度350 ℃。

2.1.3 供試品溶液制備 取小葉榕（批號2019071602G）粗粉約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，稱定質量，加熱回流提取90 min，放冷，稱定質量，用提取溶劑補足減失的質量，搖勻，濾過，合并濾液，取0.5 mL 濾液，加入70%甲醇定容至10 mL，即得（生藥量質量濃度為1 mg／mL）。

2.1.4 結果 正離子及負離子掃描模式下的圖譜見圖1～2。通過Compound discoverer 軟件搜索及質譜二級碎片確認，準確性相對較高的化合物有77個，其中峰面積大于20 萬且在中藥本地數據庫或Thermo 公司自建的數據庫中best match 大于80 分的化合物共10 個，結果見表1。

圖1 正離子掃描模式下圖譜Fig.1 Spectrum in positive ion scan mode

2.2 4 種成分含量測定

2.2.1 色譜條件 Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相甲醇（A）-0.05%磷酸（B），梯度洗脫，程序見表2；檢測波長340 nm；柱溫35 ℃；體積流量1.0 mL／min；進樣量10 μL。

2.2.2 溶液制備

2.2.2.1 混合對照品 取肉桂酸、異葒草苷、異牡荊苷各10 mg，牡荊苷2.5 mg，精密稱定，置于20 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度得混合對照品母液。取混合對照品母液1.0 mL 置于25 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得每1 mL 含肉桂酸0.02 mg、異葒草苷0.02 mg、牡荊苷0.005 mg、異牡荊苷0.02 mg 的混合對照品溶液。

2.2.2.2 供試品 取小葉榕藥材，粉碎成粗粉，取約1.0 g，精密稱定，加入甲醇50 mL，密塞，稱定質量，加熱回流提取90 min，放冷，稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

表1 小葉榕中的主要成分Tab.1 Main constituents of F.miconcinna

圖2 負離子掃描模式下圖譜Fig.2 Spectrum in negative ion scanning mode

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution programs

2.2.2.3 空白溶液 取甲醇作為空白溶液。

2.2.3 專屬性試驗 分別精密吸空白溶液、混合對照品溶液、供試品溶液各10 μL，在“2.2.1”項條件下進樣分析，記錄色譜圖。結果，在該色譜條件下，各峰間分離度均大于1.5，其他成分對待測成分色譜峰的測定無干擾，理論板數以牡荊苷峰計不低于3 000，色譜圖見圖3。

2.2.4 線性關系考察 分別精密吸取“2.2.2.1”項下混合對照品母液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 置于10 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得系列濃度的混合對照品溶液。在“2.2.1”項色譜條件下進樣分析，以峰面積為縱坐標（Y），對照品質量濃度為橫坐標（X），進行回歸，見表3。結果表明，各成分在各自范圍內線性關系良好。

2.2.5 精密度試驗 取“2.2.2.1”項下混合對照品溶液，在“2.2.1”項條件下連續進樣6 次，進樣量10 μL，測得肉桂酸、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷的峰面積RSD 分別為1.83%、1.85%、1.63%、1.21%，表明儀器精密度良好。

圖3 各成分HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

表3 各成分線性關系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.2.6 重復性試驗 取同一批小葉榕（批號2019071602G），按“2.2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液6 份，在“2.2.1”項條件下進樣，進樣量10 μL，測得肉桂酸、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷的峰面積RSD 分別為1.32%、1.73%、1.90%、1.57%，表明該方法重復性良好。

2.2.7 穩定性試驗 取小葉榕（批號2019071602G），按“2.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項條件下，分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣，進樣量10 μL，測得肉桂酸、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷的峰面積RSD 分別為1.76%、1.73%、1.91%、1.12%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取已知含量的小葉榕（批號2019071602G）約0.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入混合對照品母液2 mL。按“2.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，在“2.2.1”項條件下進樣。計算各成分回收率。結果見表4。

2.2.9 樣品含量測定 分別取6 批樣品，按“2.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣，記錄肉桂酸、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷的峰面積，計算各成分的含量。由于中藥材的質量容易受產地、生長年限、采收、加工等因素的影響，因此，本研究建議將各成分含量平均值的80% 設為最低限度。結果見表5。

3 討論

本研究采用UPLC-ESI-Orbitrap-MS 法對其主要成分分析時，發現小葉榕中含有肉桂酸，目前未見有文獻報道。藥理作用研究表明肉桂酸具有抗菌、消炎、升高白細胞等作用［12］。異葒草苷具有較好的體內外抗呼吸道合胞病毒的活性，且能一定程度緩解病毒性炎癥，其主要在病毒進入宿主細胞后的復制階段起作用，能抑制與病毒復制晚期相關的L、F 和P 蛋白的mRNA 表達［13］。Tan 等［14］研究表明，牡荊苷干預后模型小鼠痛覺過敏細胞因子TNF-α、IL-6、IL-33 生成減少，IL-10 分泌增多，從而起到抗炎鎮痛的作用。Lee 等［15］研究指出，牡荊苷還具有明顯抑制3 型副流行性感冒病毒作用。另外，牡荊苷和異牡荊苷均具有止咳作用［16］。因此，以藥效為導向，結合已有的質量標準研究情況，本研究選取肉桂酸、異葒草苷、牡荊苷及異牡荊苷作為含量測定指標。

表4 各成分加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

表5 各成分含量測定結果（mg／g，n＝2）Tab.5 Results of content determination of various constituents（mg／g，n＝2）

本研究比較了溶劑（70% 甲醇、甲醇、乙醇）、提取方法（連續回流提取法和超聲提取法）及提取時間（60、90、120 min）對4 種成分含量的影響，結果表明以甲醇作為提取溶劑，加熱回流提取90 min 的制備方法所獲得的4 種成分含量較高。對樣品采用二極管陣列檢測器在200～400 nm波長范圍內進行掃描，4 種成分在270、340 nm 處均有較大吸收，但在270 nm 處，干擾峰較多，340 nm處無干擾峰，且各吸收峰的峰面積、峰形及分離度等指標較為理想，基線較為平穩。比較了甲醇-水、甲醇-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液3 種流動相系統。結果顯示，采用甲醇-0.05%磷酸溶液，梯度洗脫，4 種成分的色譜峰分離效果較好，各色譜峰的分離度、對稱因子、理論塔板數均能達到要求。

本研究測定了3 個不同產地的6 批樣品中4 種成分的含量，結果顯示，牡荊苷、異牡荊苷批間差異較小，但肉桂酸、異葒草苷批間差異較大，產地同為廣州的3 批樣品，含量相差較大，可能是受生長年限、采收時間和貯存條件等因素的影響。

本研究通過UPLC-ESI-Orbitrap-MS 法對小葉榕主要成分進行鑒定分析，在對牡荊苷與異牡荊苷2種成分質量控制的基礎上增加了肉桂酸和異葒草苷的含量測定，建立HPLC 法同時測定小葉榕中4 種成分的含量，并比較了6 批樣品中4 種成分的質量差異性，以期為小葉榕及含有小葉榕的相關制劑質量標準的研究與提高提供參考。