HPLC 法同時(shí)測(cè)定小葉榕中4 種成分

王新雨，黃煒忠，張馮榮，滕云霞

（廣東羅浮山國(guó)藥股份有限公司，廣東惠州 516133）

小葉榕又名落地金錢，為桑科植物榕樹Ficus miconcinna MiqLf.的干燥嫩枝和葉。具有清熱發(fā)表、解毒消腫、祛濕止痛的功效。主治流感、慢性支氣管炎、扁桃體炎等癥［1］。主要含黃酮類、三萜類、甾醇類等成分［2-3］。藥理作用研究表明其具有清除自由基、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗病毒、化痰止咳平喘等作用［4-6］。以小葉榕干浸膏為原料的咳特靈制劑，臨床上在治療咳嗽方面取得了良好的效果［7-8］。目前，法定標(biāo)準(zhǔn)中，小葉榕及其相關(guān)制劑的質(zhì)量控制定量指標(biāo)均為牡荊苷和異牡荊苷的總含量［1，9］，但該指標(biāo)不能反映其多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，難以全面反映藥材質(zhì)量。文獻(xiàn)記載中同樣多為對(duì)牡荊苷和異牡荊苷2 種成分的含量進(jìn)行測(cè)定［10］。徐勤等［11］用UPLC-QQQ-MS 測(cè)定了小葉榕中12 種成分的含量，但儀器成本較高，很難在企業(yè)中普及。而HPLC 法操作簡(jiǎn)單、成本相對(duì)較低，容易推廣。因此，本研究采用UPLC-ESI-Orbitrap-MS 對(duì)其主要成分進(jìn)行鑒定分析，并建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定小葉榕中4 種成分的含量，以全面控制小葉榕藥材的質(zhì)量，以期為小葉榕及含有小葉榕相關(guān)制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；Orbitrap Fusion 超高分辨三合一質(zhì)譜儀；Vanquish 超高效液相（美國(guó)Thermo Fisher公司）；KQ-300VDE 型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AB135-S 電子天平（0.01 mg，瑞士梅特勒托利多公司）。

1.2 試劑 甲醇（科魯?shù)禄す煞萦邢薰荆?hào)520602）；磷酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)20190901）；乙醇（西隴科學(xué)股份有限公司，批號(hào)1812201）；肉桂酸（批號(hào)110786-201604，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.8%）、異葒草苷（批號(hào)111974-201401，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.0%）、牡荊苷對(duì)照品（批號(hào)111687-201704，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.9%），均購于中國(guó)食品藥品檢定研究院；異牡荊苷對(duì)照品（上海鴻永生物科技有限公司，批號(hào)250215-201903，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）。

1.3 原料 從廣州、惠州、佛山等地自購的小葉榕藥材6 批，經(jīng)廣東羅浮山國(guó)藥股份有限公司廖志鐘主任中藥師鑒定，均為桑科植物榕樹Ficus miconcinna MiqLf.的干燥嫩枝和葉。批號(hào)按采集的先后順序編號(hào)，依次為2019071601G（佛山）、2019071602G（廣州）、2019071603G（廣州）、2019071604G（惠州）、2019071605G（廣州）、2019071606G（惠州）。

2 方法與結(jié)果

2.1 小葉榕主要成分分析

2.1.1 分析條件 采用Waters Acquity UPLC HSS T3 柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相0.1%甲酸水（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～16 min，5%～100% B；16～22 min，100% B）；體積流量0.3 mL／min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源類型H-ESI；掃描范圍（m／z）100～1 000；正離子3 500 V；負(fù)離子2 500 V；離子轉(zhuǎn)移管溫度320 ℃；汽化器溫度350 ℃。

2.1.3 供試品溶液制備 取小葉榕（批號(hào)2019071602G）粗粉約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流提取90 min，放冷，稱定質(zhì)量，用提取溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，合并濾液，取0.5 mL 濾液，加入70%甲醇定容至10 mL，即得（生藥量質(zhì)量濃度為1 mg／mL）。

2.1.4 結(jié)果 正離子及負(fù)離子掃描模式下的圖譜見圖1～2。通過Compound discoverer 軟件搜索及質(zhì)譜二級(jí)碎片確認(rèn)，準(zhǔn)確性相對(duì)較高的化合物有77個(gè)，其中峰面積大于20 萬且在中藥本地?cái)?shù)據(jù)庫或Thermo 公司自建的數(shù)據(jù)庫中best match 大于80 分的化合物共10 個(gè)，結(jié)果見表1。

圖1 正離子掃描模式下圖譜Fig.1 Spectrum in positive ion scan mode

2.2 4 種成分含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇（A）-0.05%磷酸（B），梯度洗脫，程序見表2；檢測(cè)波長(zhǎng)340 nm；柱溫35 ℃；體積流量1.0 mL／min；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 溶液制備

2.2.2.1 混合對(duì)照品 取肉桂酸、異葒草苷、異牡荊苷各10 mg，牡荊苷2.5 mg，精密稱定，置于20 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度得混合對(duì)照品母液。取混合對(duì)照品母液1.0 mL 置于25 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得每1 mL 含肉桂酸0.02 mg、異葒草苷0.02 mg、牡荊苷0.005 mg、異牡荊苷0.02 mg 的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2.2 供試品 取小葉榕藥材，粉碎成粗粉，取約1.0 g，精密稱定，加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流提取90 min，放冷，稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

表1 小葉榕中的主要成分Tab.1 Main constituents of F.miconcinna

圖2 負(fù)離子掃描模式下圖譜Fig.2 Spectrum in negative ion scanning mode

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution programs

2.2.2.3 空白溶液 取甲醇作為空白溶液。

2.2.3 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸空白溶液、混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，在“2.2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果，在該色譜條件下，各峰間分離度均大于1.5，其他成分對(duì)待測(cè)成分色譜峰的測(cè)定無干擾，理論板數(shù)以牡荊苷峰計(jì)不低于3 000，色譜圖見圖3。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品母液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 置于10 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得系列濃度的混合對(duì)照品溶液。在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行回歸，見表3。結(jié)果表明，各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，進(jìn)樣量10 μL，測(cè)得肉桂酸、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷的峰面積RSD 分別為1.83%、1.85%、1.63%、1.21%，表明儀器精密度良好。

圖3 各成分HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

表3 各成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批小葉榕（批號(hào)2019071602G），按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份，在“2.2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，測(cè)得肉桂酸、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷的峰面積RSD 分別為1.32%、1.73%、1.90%、1.57%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取小葉榕（批號(hào)2019071602G），按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)條件下，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，測(cè)得肉桂酸、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷的峰面積RSD 分別為1.76%、1.73%、1.91%、1.12%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的小葉榕（批號(hào)2019071602G）約0.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入混合對(duì)照品母液2 mL。按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份，在“2.2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣。計(jì)算各成分回收率。結(jié)果見表4。

2.2.9 樣品含量測(cè)定 分別取6 批樣品，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄肉桂酸、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷的峰面積，計(jì)算各成分的含量。由于中藥材的質(zhì)量容易受產(chǎn)地、生長(zhǎng)年限、采收、加工等因素的影響，因此，本研究建議將各成分含量平均值的80% 設(shè)為最低限度。結(jié)果見表5。

3 討論

本研究采用UPLC-ESI-Orbitrap-MS 法對(duì)其主要成分分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)小葉榕中含有肉桂酸，目前未見有文獻(xiàn)報(bào)道。藥理作用研究表明肉桂酸具有抗菌、消炎、升高白細(xì)胞等作用［12］。異葒草苷具有較好的體內(nèi)外抗呼吸道合胞病毒的活性，且能一定程度緩解病毒性炎癥，其主要在病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后的復(fù)制階段起作用，能抑制與病毒復(fù)制晚期相關(guān)的L、F 和P 蛋白的mRNA 表達(dá)［13］。Tan 等［14］研究表明，牡荊苷干預(yù)后模型小鼠痛覺過敏細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-33 生成減少，IL-10 分泌增多，從而起到抗炎鎮(zhèn)痛的作用。Lee 等［15］研究指出，牡荊苷還具有明顯抑制3 型副流行性感冒病毒作用。另外，牡荊苷和異牡荊苷均具有止咳作用［16］。因此，以藥效為導(dǎo)向，結(jié)合已有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究情況，本研究選取肉桂酸、異葒草苷、牡荊苷及異牡荊苷作為含量測(cè)定指標(biāo)。

表4 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

表5 各成分含量測(cè)定結(jié)果（mg／g，n＝2）Tab.5 Results of content determination of various constituents（mg／g，n＝2）

本研究比較了溶劑（70% 甲醇、甲醇、乙醇）、提取方法（連續(xù)回流提取法和超聲提取法）及提取時(shí)間（60、90、120 min）對(duì)4 種成分含量的影響，結(jié)果表明以甲醇作為提取溶劑，加熱回流提取90 min 的制備方法所獲得的4 種成分含量較高。對(duì)樣品采用二極管陣列檢測(cè)器在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，4 種成分在270、340 nm 處均有較大吸收，但在270 nm 處，干擾峰較多，340 nm處無干擾峰，且各吸收峰的峰面積、峰形及分離度等指標(biāo)較為理想，基線較為平穩(wěn)。比較了甲醇-水、甲醇-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液3 種流動(dòng)相系統(tǒng)。結(jié)果顯示，采用甲醇-0.05%磷酸溶液，梯度洗脫，4 種成分的色譜峰分離效果較好，各色譜峰的分離度、對(duì)稱因子、理論塔板數(shù)均能達(dá)到要求。

本研究測(cè)定了3 個(gè)不同產(chǎn)地的6 批樣品中4 種成分的含量，結(jié)果顯示，牡荊苷、異牡荊苷批間差異較小，但肉桂酸、異葒草苷批間差異較大，產(chǎn)地同為廣州的3 批樣品，含量相差較大，可能是受生長(zhǎng)年限、采收時(shí)間和貯存條件等因素的影響。

本研究通過UPLC-ESI-Orbitrap-MS 法對(duì)小葉榕主要成分進(jìn)行鑒定分析，在對(duì)牡荊苷與異牡荊苷2種成分質(zhì)量控制的基礎(chǔ)上增加了肉桂酸和異葒草苷的含量測(cè)定，建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定小葉榕中4 種成分的含量，并比較了6 批樣品中4 種成分的質(zhì)量差異性，以期為小葉榕及含有小葉榕的相關(guān)制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究與提高提供參考。