干漆及大黃?蟲丸中非法染色成分808 猩紅的檢測

鐘水生，張華鋒，王亞瓊，孫秀華，周 堅

（蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，江蘇蘇州 215000）

干漆，異名漆渣，是漆樹科植物漆樹Toxicodendron vernicifluum（Stokes）F.A.Barkl.的樹脂生漆經(jīng)加工后的干燥品，有破瘀通經(jīng)、消積殺蟲的功效，主要用于瘀血閉經(jīng)癥瘕積聚蟲積腹痛等病癥［1-2］。大黃?蟲丸為干漆與其他藥材如熟大黃、土鱉蟲、水蛭等11 味組方制成的中藥制劑，具有活血破瘀、通經(jīng)消癥的功效，主要用于瘀血內(nèi)停所致的癥瘕、閉經(jīng)，癥見腹部腫塊、肌膚甲錯等病癥［1］，現(xiàn)代臨床也有將其用于心絞痛、乙型肝炎纖維化和慢性前列腺炎等的治療［3-8］。

對收集到的大黃?蟲丸進行按國家藥品標(biāo)準(zhǔn)檢驗時發(fā)現(xiàn)，部分廠家的大黃?蟲丸樣品的薄層鑒別試驗中呈現(xiàn)出未知紅色斑點。經(jīng)查閱相關(guān)文獻，并刮取該未知紅色斑點進行篩查，結(jié)果疑似為808 猩紅。808 猩紅，為偶氮類紅色化工染料，常用于涂料、油墨、油漆、皮革等化工產(chǎn)品的著色，它并非食用色素，其在機體內(nèi)經(jīng)生物轉(zhuǎn)化分解，可形成致癌物，具有致癌和致突變等毒性，嚴(yán)重影響患者的安全與健康［9-10］。

目前尚未有干漆及干漆制劑中染色成分研究的報道。為進一步確證并探索808 猩紅的來源，本課題組參考808 猩紅測定的相關(guān)報道［11-16］，建立了干漆及大黃?蟲丸中808 猩紅的檢測方法，以期為干漆及干漆制劑的質(zhì)量控制乃至安全用藥提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695-2998 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；島津LC-20AD-8050 液質(zhì)聯(lián)用儀（日本島津公司）；梅特勒XS205DC 分析天平（瑞士梅特勒公司）。

1.2 試劑與藥物 808 猩紅（中國食品藥品檢定研究院，批號111940-201804）；乙腈為色譜純，水為重蒸水，甲酸為色譜純，乙酸銨為分析純。大黃?蟲丸為全國藥品評價性抽驗樣品，干漆（煅）飲片為部分大黃?蟲丸生產(chǎn)企業(yè)提供的留樣，并經(jīng)蘇州市藥品檢驗檢測研究中心張華鋒副主任中藥師鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照試劑溶液制備 精密稱取808 猩紅對照試劑適量，加甲醇溶解，制成每1 mL 含5 μg 的溶液，作為對照試劑溶液。供HPLC 測定的對照試劑溶液，以流動相250 倍稀釋后可用于HPLC-MS／MS進行確證分析。

2.2 供試品溶液制備

2.2.1 干漆供試品溶液制備 取干漆（煅）適量，研細，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加三氯甲烷25 mL，超聲處理30 min，放冷，濾過，容器及濾渣用三氯甲烷50 mL 分次洗滌，合并濾液，蒸干，殘渣用甲醇適量溶解，并轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2.2 大黃?蟲丸供試品溶液制備 取大黃?蟲丸水蜜丸或水丸適量，研細，取約3 g，精密稱定；或取大蜜丸適量，剪碎，取約6 g，精密稱定，精密加入硅藻土3 g，研勻，取約4.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加三氯甲烷25 mL，超聲處理30 min，放冷，濾過，容器及濾渣用三氯甲烷50 mL分次洗滌，合并濾液，蒸干，殘渣用甲醇適量溶解，并轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

以上供HPLC 測定的供試品溶液，以流動相50 倍稀釋后可用于HPLC-MS／MS 進行確證分析。

2.3 液相色譜-UV 條件 Boston C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.1% 甲酸；體積流量1 mL／min；柱溫30 ℃；進樣量50 μL；檢測波長518 nm。

2.4 專屬性試驗 精密吸取對照試劑溶液、干漆供試品溶液與大黃?蟲丸供試品溶液各50 μL，注入液相色譜儀測定，結(jié)果陽性樣品出現(xiàn)與對照試劑溶液相同保留時間的色譜峰，而陰性樣品無相應(yīng)的色譜峰，見圖1。陽性樣品中與808 猩紅對照試劑溶液保留時間一致的色譜峰的吸收光譜與808 猩紅對照試劑溶液一致。

圖1 干漆及大黃?蟲丸HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of dried lacquer and Dahuang Zhechong Pills

2.5 液相色譜-質(zhì)譜確證試驗

2.5.1 色譜條件 Waters HSS C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相乙腈-0.1%甲酸（80 ∶20）；體積流量0.3 mL／min；柱溫35 ℃；進樣量2 μL。

2.5.2 質(zhì)譜條件 接口電壓3.0 kV；接口溫度300 ℃；DL 溫度 250 ℃；霧化氣體積流量3 L／min；干燥器體積流量10 L／min；加熱氣體積流量10 L／min；離子化模式ESI+；模式多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），選擇m／z 368.20～275.05 和m／z 368.20～219.10 作為檢測離子對，碰撞電壓分別為-17、-34 eV。

精密吸取供HPLC-MS／MS 確證的對照試劑溶液與陽性供試品溶液各2 μL，注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定，結(jié)果干漆和大黃?蟲丸陽性樣品的m／z 368.20～275.05 和m／z 368.20～219.10 離子流色譜圖中，均出現(xiàn)與對照試劑色譜保留時間相同的色譜峰，且色譜峰質(zhì)譜中，兩監(jiān)測離子對的豐度比與對照試劑基本一致。見圖2。

圖2 各樣品MRM 圖Fig.2 MRM chromatograms of various samples

2.6 線性關(guān)系考察 精密稱取808 猩紅對照試劑6.66 mg，置100 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得對照試劑溶液Ⅰ。精密吸取對照試劑溶液Ⅰ適量，加甲醇依次制成質(zhì)量濃度為6.66 μg／mL（對照試劑溶液Ⅱ）和0.666 μg／mL的對照試劑溶液（對照試劑溶液Ⅲ）。分別精密吸取對照試劑溶液Ⅰ50 μL；對照試劑溶液Ⅱ10、20、50 μL；對照試劑溶液Ⅲ10、20、50 μL，在“2.3”項條件下進樣，以對照試劑進樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進行回歸，得回歸方程為Y＝2.867×106X+3.040×103（r ＝1.000），表明808 猩紅在0.033 3～3.33 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗 精密吸取上述808 猩紅對照試劑溶液Ⅱ50 μL，在“2.3”項條件下連續(xù)進樣6次，測得808 猩紅峰面積RSD 為0.1%。表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗

2.8.1 干漆 取同一批號的干漆陽性樣品（D 廠，批號170602）0.5 g，共6 份，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項條件下進樣，計算含量。測得808 猩紅的平均含量為254.5 μg／g，RSD 為1.6%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.8.2 大黃?蟲丸 取同一批號的大黃?蟲丸陽性樣品（水蜜丸，B 廠，批號180702）適量，研細，取3.0 g，共6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項條件下進樣，計算含量。測得808 猩紅的平均含量為37.3 μg／g，RSD為0.9%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗

2.9.1 干漆 取同一批號的干漆陽性樣品0.5 g，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項條件下，分別于0、2、4、6、8、12 h 進樣，測得峰面積RSD 為0.9%，表明供試品溶液中808 猩紅在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9.2 大黃?蟲丸 取同一批號的大黃?蟲丸陽性樣品適量，研細，取3.0 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項條件下，分別于0、2、4、6、8、12 h 進樣，測得峰面積RSD為1.2%，表明供試品溶液中808 猩紅在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率試驗

2.10.1 干漆 精密稱取已知808 猩紅含量的干漆陽性樣品（D 廠，批號170602，含量254.5 μg／g）粉末0.25 g，置具塞錐形瓶中，精密加入對照試劑溶液Ⅰ1 mL，揮干甲醇，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液6 份，在“2.3”項條件下進樣，計算加樣回收率，測得808 猩紅平均加樣回收率為100.2%，RSD 為1.2%。見表1。

表1 干漆加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab.1 Results of recovery tests for dried lacquer（n＝6）

2.10.2 大黃?蟲丸 精密稱取已知808 猩紅含量的大黃?蟲丸陽性樣品（水蜜丸，B 廠，批號180702，含量37.3 μg／g）粉末1.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入對照試劑溶液Ⅰ1 mL，揮干甲醇，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液6 份，在“2.3”項條件下進樣，計算加樣回收率，測得808猩紅平均加樣回收率為99.8%，RSD 為1.8%。見表2。

表2 大黃?蟲丸加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for Dahuang Zhechong Pills（n＝6）

2.11 檢測限 將808 猩紅對照試劑溶液稀釋，在“2.3”項條件下進樣，以信噪比（S／N）在3 左右所對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢測限。測得808 猩紅的檢出限為1.67 ng。

2.12 樣品檢測 取不同廠家不同批次干漆樣品6批（涉及生產(chǎn)企業(yè)6 家）和大黃?蟲丸樣品93 批（涉及生產(chǎn)企業(yè)13 家），按“2.2”項下方法制備供試品溶液。精密吸取對照試劑溶液與供試品溶液各50 μL，在“2.3”項條件下進樣測定；陽性樣品再以液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進行進一步確證。結(jié)果D 廠提供的1 批干漆飲片（批號170602）檢出808 猩紅，含量為254.5 μg／g；16 批大黃?蟲丸中檢出808 猩紅，涉及生產(chǎn)企業(yè)4 家，結(jié)果見表3。

表3 大黃?蟲丸中808 猩紅含量檢出結(jié)果（μg／g）Tab.3 Results of content determination of 808 scarlet in Dahuang Zhechong Pills（μg／g）

3 討論

大黃?蟲丸中組方藥味較多，成分也復(fù)雜，且其中干漆的比例僅有1.2%～2.3%，簡單的超聲處理的方法難以有效地檢測到其中的808 猩紅。因此嘗試采用萃取濃縮的方式進行處理。比較了乙醇超聲處理后濃縮、三氯甲烷超聲處理后濃縮的方式，發(fā)現(xiàn)經(jīng)乙醇超聲處理后濃縮的樣品黏度較大，不利于808 猩紅的復(fù)溶，而三氯甲烷超聲處理能較好的避免這個問題，且具有較好的提取效率，故最終選用三氯甲烷作為提取溶劑。

本研究收集到的93 批大黃?蟲丸中有16 批樣品檢出808 猩紅，涉及4 個生產(chǎn)廠家。對收集的大黃?蟲丸投料所用藥味進行染色劑808 猩紅快速篩查，發(fā)現(xiàn)1 家大黃?蟲丸陽性樣品生產(chǎn)企業(yè)提供的干漆樣品中疑似檢出808 猩紅，且該干漆樣品在視野下呈現(xiàn)有紅色粉末及塊狀物，后期采用建立的干漆中808 猩紅的液相和液質(zhì)檢測方法進行進一步檢測，證實確為檢出808 猩紅，因此成藥中的染色劑808 猩紅最有可能是干漆帶入。

查閱相關(guān)文獻，干漆為生漆中的漆酚在漆酶的作用下，在空氣中氧化生成的黑色樹脂狀物［17］，然而現(xiàn)代社會為了滿足涂裝修飾的要求，人們會在生漆的加工過程中加入各種添加劑，如分散劑、顏料等［18］。由于2020 年版《中國藥典》 對干漆來源的描述較為寬泛，加上尚未有相關(guān)的檢測方法來檢測其中的添加劑，導(dǎo)致部分不法商家為追逐利益而混入含有添加劑的“漆渣”，進而使干漆及含干漆制劑大黃?蟲丸中非法染色成分808 猩紅的檢出。

然干漆和大黃?蟲丸樣品808 猩紅的檢出僅集中在部分廠家的部分批次當(dāng)中，并非同一廠家的每一批都檢出808 猩紅，表明飲片企業(yè)或中成藥生產(chǎn)企業(yè)在采購干漆時，未進行該方面的檢查，且含808 猩紅的藥材已進入中成藥生產(chǎn)企業(yè)，并對中成藥的藥用安全造成了嚴(yán)重影響。這提示，一方面，飲片企業(yè)、中成藥生產(chǎn)企業(yè)及其他干漆使用單位在藥材或飲片的采購中，應(yīng)嚴(yán)把藥材來源，除按常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)檢驗外，還應(yīng)進行染色劑檢查，管控藥材質(zhì)量；另一方面，藥品監(jiān)管部門在日常工作中，應(yīng)加強規(guī)范干漆藥材及飲片的市場管理，重視干漆采制加工環(huán)節(jié)的監(jiān)管，并逐步將808 猩紅的檢查方法納入干漆及含干漆制劑的常規(guī)檢驗中。

本實驗建立的808 猩紅檢測方法，操作簡單，重現(xiàn)性好，能滿足實驗需求，且課題組首次在干漆及干漆制劑中檢出非法染色成分808 猩紅，多批大黃?蟲丸和干漆中808 猩紅的檢出提示著干漆和大黃?蟲丸，乃至其他含干漆制劑（包括平消片、腦塞通丸等）的臨床使用可能存在著較大的安全隱患，需要進行嚴(yán)格的監(jiān)管。