枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵黃精工藝優(yōu)化及其質(zhì)量、藥理活性

郭 寧 ，王懷瑩 ，陳 容，高路西，廖貞爽，羅小倩，宋 旭，李麗霞?

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川成都 610000；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院天然藥物研究中心，四川成都 611130）

黃精為百合科黃精屬植物滇黃精 Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.、黃精Polygonatum sibiricum Red或多花黃精Polygonatum cyrtonema Hua 的干燥根莖，其味甘，性平，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎的功效［1］，含有黃酮、甾體皂苷、多糖等成分，有著抗疲勞［2］、調(diào)節(jié)免疫力［3］、降血糖［4］等藥理作用。它作為常用補(bǔ)益藥物，第一批被衛(wèi)生部納入《既是食品又是藥品的物品名單》，但生品服用時(shí)口舌麻木，刺激咽喉，接觸過生品或其汁液后皮膚會(huì)產(chǎn)生瘙癢的感覺，久聞其生味有刺目之感［5］，故采收后需要經(jīng)過加工方可入藥。古人通過“九蒸九曝”［6］的方法加工黃精以消除其刺激性及不良反應(yīng)，但該方法耗時(shí)耗工。

現(xiàn)代中藥微生物發(fā)酵技術(shù)是通過微生物生長代謝及生命活動(dòng)來炮制中藥，不但可簡化加工工藝，節(jié)約能源，還能增強(qiáng)或產(chǎn)生新功效，擴(kuò)大臨床用藥范圍，降低不良反應(yīng)。因此，本實(shí)驗(yàn)將益生菌枯草芽孢桿菌和現(xiàn)代微生物固態(tài)發(fā)酵技術(shù)引入黃精加工工藝中，優(yōu)化發(fā)酵工藝，并結(jié)合藥效評(píng)價(jià)該藥材發(fā)酵前后藥效差異，以期為拓展其深加工和綜合利用、提高產(chǎn)品附加值、創(chuàng)造更高的經(jīng)濟(jì)效益提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 黃精采自云南省紅河哈尼族彝族自治州彌勒市彌勒山滇黃精種植基地，經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院天然藥物研究中心李麗霞老師鑒定為滇黃精Polygonatum kingianum coll.et Hemsl。

枯草芽胞桿菌BS01，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院倪學(xué)勤教授分離鑒定，編號(hào)M2012485，保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

薯蕷皂苷元（純度≥98%，CAS 號(hào)512-06-1，廣州亮化化工有限公司）。營養(yǎng)肉湯、瓊脂、麥芽汁培養(yǎng)基。液氮、糖原測試試劑盒（南京建成生物工程研究所）；丙二醛檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。無水葡萄糖為分析純（CAS 號(hào)50-99-7，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；無水乙醇、苯酚、濃硫酸、無水葡萄糖均為分析純；水為蒸餾水。

1.2 動(dòng)物 3 周齡健康昆明種小鼠60 只，雌雄各半，體質(zhì)量18～25 g，購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（川）2015-030。

1.3 儀器 立式壓力蒸汽滅菌鍋（型號(hào)LX-C50L，合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司）；電子天平（型號(hào)ESJ200-4A，沈陽龍騰電子有限公司）；紫外分光光度計(jì)（型號(hào)UV-2000，上海儀電分析儀器有限公司）；培養(yǎng)箱（型號(hào)DNP-30，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；潔凈工作臺(tái)（型號(hào)SW-CJ-2FD，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；酶標(biāo)儀（型號(hào)iMark 19893，美國Bio-Rad 公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（型號(hào)101A-4，上海試驗(yàn)儀器廠有限公司）；離心機(jī)（型號(hào)80-2B，江蘇新康醫(yī)療器械有限公司）；中藥鍘刀（型號(hào)KD0142，廣州膳道信息科技有限公司）。

2 方法

2.1 枯草芽孢桿菌生長曲線繪制 采用牛肉膏蛋白胨固體和液體培養(yǎng)基活化枯草芽孢桿菌，設(shè)置活化溫度為37 ℃，振蕩頻率為120 r／min［7］?；罨髶u床培養(yǎng)，每隔2 h 測定培養(yǎng)液吸光度，繪制菌株生長曲線，以確定其對數(shù)生長期末期時(shí)間。

2.2 固態(tài)發(fā)酵工藝研究

2.2.1 發(fā)酵方法 將蒸制后的藥材在60 ℃下烘若干小時(shí)，紫外照射30 min 后放入自封塑料袋中，作為發(fā)酵底物備用；取活化后的枯草芽孢桿菌菌液，以1 ∶100 比例接入液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、120 r／min 下培養(yǎng)至對數(shù)期末期，作為發(fā)酵液備用。以一定用菌量向發(fā)酵底物中加入發(fā)酵液，兩者混勻，密封塑料袋，在37 ℃下恒溫培養(yǎng)一定時(shí)間。

2.2.2 藥材前處理 在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，考察料液比（1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3）、切制粒度（0.1、0.2、0.5 cm3）、蒸制時(shí)間（30、60、90 min）對發(fā)酵后藥材感官評(píng)分［8］的影響。

2.2.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)確定 測定多糖［9］、浸出物含量［1］，以兩者各占50%的加權(quán)系數(shù)進(jìn)行綜合評(píng)分。

2.2.4 單因素試驗(yàn) 考察發(fā)酵時(shí)間（36、38、40、41、42、43、44 h），用菌量（7%、19%、21%、23%、25%），藥材含水量（45%、40%、29%、21%、11%）對“3.3”項(xiàng)下綜合評(píng)分的影響。

2.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)［10］，以“3.3”項(xiàng)下綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過Designexpert8.0.6 進(jìn)行處理。

2.3 藥材發(fā)酵前后性狀及大類成分含量比較 考察發(fā)酵品與生品性狀（顏色、質(zhì)地、氣、味）、多糖含量、浸出物含量、總皂苷含量，其中多糖、浸出物含量測定按“3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行，總皂苷含量測定以薯蕷皂苷元為對照［11-12］。

2.4 藥效學(xué)研究

2.4.1 藥液制備 將用枯草芽孢桿菌發(fā)酵后的藥材烘干，第1 次加10 倍量蒸餾水浸泡30 min 后文火煎煮0.5 h，第2 次加8 倍量蒸餾水文火煎煮0.5 h，合并2 次煎出液，靜置過濾去渣，濃縮為生藥量0.60 g／mL 的提取液，備用［13］。同法制備生黃精、人參提取液，均濃縮生藥量至0.30 g／mL。

2.4.2 分組與給藥 60 只小鼠隨機(jī)分為6 組，每組10 只，分別為發(fā)酵高（0.60 g／mL）、中（0.30 g／mL）、低（0.15 g／mL）劑量組，人參對照組（0.30 g／mL）、生黃精對照組（0.30 g／mL）、空白組（生理鹽水），均適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后給藥，每天早晚各1 次，持續(xù)15 d，灌胃體積為0.1 mL／10 g。

2.4.3 指標(biāo)檢測 末次給藥30 min 后，小鼠進(jìn)行負(fù)重游泳力竭實(shí)驗(yàn)，評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)為沉沒后5 s 仍不能浮出水面［14］，記錄力竭時(shí)間。游泳結(jié)束后，小鼠眼球采血，靜置后在4 ℃下3 500 r／min 下離心一段時(shí)間，取上層清液，試劑盒法檢測血清MDA 水平。小鼠采血后立即處死，取出胸腺和脾臟，擦干血液，稱定質(zhì)量，以臟器濕重表示胸腺、脾臟指數(shù)［15］，再取出肝臟和肌肉，置于-80 ℃冰箱中保存，試劑盒法檢測糖原水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 20.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 藥材前處理 最佳前處理方法為料液比1 ∶1，此時(shí)藥材全部潤透，并無蒸餾水殘留；切制粒度0.2 cm3，此時(shí)更易蒸透，而且方便控制烘干時(shí)間；蒸制時(shí)間30 min，此時(shí)能完全蒸透，并較節(jié)省時(shí)間。

3.2 固態(tài)發(fā)酵工藝研究

3.2.1 對數(shù)生長期末期時(shí)間測定 根據(jù)枯草芽孢桿菌生長曲線，確定制備發(fā)酵液的搖床時(shí)間為10 h。

3.2.2 單因素試驗(yàn) 表1～3 顯示，最佳發(fā)酵時(shí)間為42 h，最佳用菌量為21%，最佳藥材含水量為40%。

表1 發(fā)酵時(shí)間單因素試驗(yàn)結(jié)果

表2 用菌量單因素試驗(yàn)結(jié)果

表3 藥材含水量單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 因素水平見表4，結(jié)果見表5。通過Design-expert 8.0.6 軟件對表5 數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到二次回歸方程為Y ＝97.40-0.37A+1.65B+1.53C+4.67AB+1.64 AC-3.52BC-4.06A2-3.59B2-6.29C2（R2＝0.910 7，0.810 2）。

表4 因素水平

表5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

方差分析見表6，可知模型P＜0.01，失擬項(xiàng)P＞0.05，表明模型可反映綜合評(píng)分對固態(tài)發(fā)酵的影響；R2＝0.910 7，＝0.810 2，表明模型擬合度良好，可用于預(yù)估固態(tài)發(fā)酵后多糖、浸出物含量綜合評(píng)分的變化。響應(yīng)面分析見圖1。

表6 方差分析

通過Design-expert 8.0.6 軟件，得到最優(yōu)工藝為發(fā)酵時(shí)間41 h，用菌量22%，藥材含水量40.63%，考慮到實(shí)際操作方便，將其修正為發(fā)酵時(shí)間41 h，用菌量22%，藥材含水量40%，綜合評(píng)分97.66。在該優(yōu)化工藝下進(jìn)行5 批驗(yàn)證試驗(yàn)，測得平均綜合評(píng)分為97.43，與預(yù)測值97.66 接近（相對誤差為-0.24%），表明該工藝穩(wěn)定可行。

3.3 藥材發(fā)酵前后質(zhì)量比較

3.3.1 性狀 表7 顯示，黃精發(fā)酵后可除去其麻舌感，并增加香味。

3.3.2 各成分含量 表8 顯示，與生品比較，發(fā)酵品總多糖、總浸出物、總皂苷含量均降低，以總多糖更明顯（P＜0.01），總浸出物次之（P＜0.05）。

圖1 各因素響應(yīng)面圖

表7 黃精發(fā)酵前后性狀比較（n＝3）

表8 黃精發(fā)酵前后各成分含量比較（，n＝3）

表8 黃精發(fā)酵前后各成分含量比較（，n＝3）

注：與生品比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3.4 藥理活性實(shí)驗(yàn)

3.4.1 力竭游泳實(shí)驗(yàn) 表9 顯示，與空白組比較，人參對照組、發(fā)酵高劑量組小鼠游泳力竭時(shí)間延長（P＜0.01）；與人參對照組比較，發(fā)酵低劑量組小鼠游泳力竭時(shí)間縮短（P＜0.05），而發(fā)酵高劑量組更長（P＜0.01）。

表9 各組小鼠游泳力竭時(shí)間比較（，n＝10）

表9 各組小鼠游泳力竭時(shí)間比較（，n＝10）

注：與空白組比較，??P＜0.01；與人參對照組比較，△P ＜0.05，△△P＜0.01。

3.4.2 臟器指數(shù) 表10 顯示，與空白組比較，人參對照組、發(fā)酵高劑量組小鼠脾臟指數(shù)升高（P＜0.01）；與人參對照組比較，發(fā)酵低劑量組小鼠脾臟指數(shù)降低（P＜0.05），而發(fā)酵高劑量組更高（P＜0.01）。與空白組比較，人參對照組及發(fā)酵中、高劑量組小鼠胸腺指數(shù)升高（P＜0.05，P＜0.01）。

表10 各組小鼠臟器指數(shù)比較（，n＝10）

表10 各組小鼠臟器指數(shù)比較（，n＝10）

注：與空白組比較，?P ＜0.05，??P ＜0.01；與人參對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

3.4.3 血清MDA 水平 表11 顯示，與空白組比較，發(fā)酵高劑量組小鼠血清MDA 水平降低（P＜0.01）；與人參對照組比較，發(fā)酵中、高劑量組小鼠血清MDA 水平降低（P＜0.01）。

表11 各組小鼠血清MDA 水平比較（，n＝10）

表11 各組小鼠血清MDA 水平比較（，n＝10）

注：與空白組比較，??P＜0.01；與人參對照組比較，△△P＜0.01。

3.4.4 糖原水平 表12 顯示，與空白組比較，人參對照組、生黃精對照組及發(fā)酵中、高劑量組小鼠肝糖原水平升高（P＜0.05，P＜0.01）；與人參對照組比較，生黃精對照組、發(fā)酵低劑量組小鼠肝糖原水平降低（P＜0.05），發(fā)酵高劑量組升高（P＜0.01）。與空白組比較，各給藥組小鼠肌糖原水平升高（P＜0.05，P＜0.01）；與人參對照組比較，各給藥組小鼠肌糖原水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表12 各組小鼠糖原水平比較

4 討論與結(jié)論

枯草芽孢桿菌有不易致死的芽孢，后者以活菌狀態(tài)進(jìn)入動(dòng)物腸道后快速消耗腸道中氧氣，維持厭氧環(huán)境，促進(jìn)厭氧有益菌生長，抑制需氧有害菌生長［16］，同時(shí)還能提高免疫球蛋白和抗體水平，增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫功能，改善群體免疫力，已被我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列入飼料添加劑目錄名單，越來越多地被研制成綠色的微生物制劑，在畜牧養(yǎng)殖業(yè)、飼料加工業(yè)中均得到廣泛應(yīng)用，趙彩艷等［17］采用該菌對豆粕發(fā)酵生產(chǎn)抑菌飼料進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)它能提高群體免疫力。以枯草芽孢桿菌來對黃精發(fā)酵時(shí)，可在降低生品刺激性的同時(shí)引入益生菌。

本實(shí)驗(yàn)以枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵黃精后，在發(fā)酵完畢拆袋時(shí)聞到明顯的芳香性氣味，食之微有甜味，無其他刺激性氣味。從發(fā)酵品性狀特征的變化來看能達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康模遗c傳統(tǒng)黃精加工的“九蒸九制”方法相比可大大減小時(shí)間精力。

結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌對黃精進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵后，多糖、浸出物、總皂苷含量均有一定程度的下降，可能與消耗了該藥材部分物質(zhì)有關(guān)，同時(shí)麻舌感消失，香氣增加，表明還有其他成分發(fā)生了變化或產(chǎn)生了新成分。藥理實(shí)驗(yàn)證明黃精，發(fā)酵后與發(fā)酵前相比能顯著增強(qiáng)小鼠脾臟、胸腺的臟器指數(shù)，并可降低MDA、肌糖原水平，增加肝糖原水平，延長力竭游泳時(shí)間，表明該藥材發(fā)酵后能發(fā)揮更好的抗疲勞、抗氧化作用。但發(fā)酵后產(chǎn)生的新化合物是什么，發(fā)酵后黃精引入的枯草芽孢桿菌在進(jìn)入體內(nèi)后是否會(huì)發(fā)揮對腸道及全身的藥理活性來協(xié)同增強(qiáng)療效尚不明確，還有待進(jìn)一步研究。