大黃素對TNF-α 誘導的類風濕性關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞增殖的影響

孟慶良 ，孟婉婷 ，卞 華，鄭福增?，谷慧敏，左瑞庭，周子朋，王慧蓮，苗喜云，馬俊福

（1.河南省中醫(yī)院風濕病科，河南鄭州 450002；2.河南中醫(yī)藥大學／上海中醫(yī)藥大學中醫(yī)系，河南鄭州 450002；3.南陽理工學院張仲景國醫(yī)學院，河南南陽 473004）

類風濕關節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的自身免疫性慢性疾病，慢性炎癥、滑膜增生和關節(jié)進行性破壞是其重要的病理特征；在RA 的發(fā)生發(fā)展過程中，成纖維樣滑膜細胞是其重要的效應細胞，可通過異常增殖、產生炎癥因子逐漸浸潤至包括軟骨和骨關節(jié)在內的多種關節(jié)或器官，嚴重威脅著人們的身體健康［1-2］。因此，抑制成纖維樣滑膜細胞增殖、控制或減輕滑膜炎癥進展是治療RA的重要策略。

目前，臨床上治療RA 的常用藥物為甲氨喋呤和來氟米特等生物制劑，但因其不良反應和價格昂貴等因素給患者用藥帶來嚴重負擔。RA 屬于中醫(yī)學的“痹癥”范疇，中藥治療RA 一直是研究的熱點。大黃素是藥用植物大黃的有效成分之一，具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗癌等多種生物活性，其對角膜炎和心肌炎等多種自身免疫性具有良好的改善作用［3-5］。核轉錄因子κB（nuclearfactor-κB，NFκB）信號通路是一種細胞內重要的信號轉導通路，可通過腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、B 細胞活化因子和病毒等刺激因子的活化誘導產生炎癥因子參與炎癥反應，也可通過調控細胞的增殖和凋亡等生物學過程參與RA 的發(fā)生發(fā)展［6-7］。已有研究［8］指出，大黃素可通過抑制成纖維樣滑膜細胞增殖和轉移發(fā)揮抗RA 發(fā)生發(fā)展的作用，但其對炎癥因子及NF-κB 信號通路的影響尚不清楚。TNF-α 是一種常見的促炎因子，可造成成纖維樣滑膜細胞炎癥損傷［9］。本研究以人類風濕性關節(jié)炎成纖維樣滑膜HFLS-RA 細胞為研究對象，通過觀察大黃素對TNF-α 刺激的HFLS-RA 細胞增殖凋亡、炎癥因子和NF-κB 信號通路的影響，探討其抗RA 發(fā)生發(fā)展的分子機制，以期為大黃素的臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與試劑 大黃素（純度＞98%，批號20161025）購于北京索萊寶科技公司；胰蛋白酶（批號SH30042.01）、DMEM 高糖培養(yǎng)基（批號SH30022.018B）購于美國HyClone 公司；胎牛血清（批號16000-44）、青鏈霉素（批號1450572）購于美國Gibico 公司；TNF-α（批號YW-6）購于上海生物工程公司；噻唑藍（Methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide，MTT；批號 2035B358）購于美國Promega 公司；Trizol 試劑（批號DP121221）購于北京天根生物有限公司；p-IκBα 抗體（貨號ab7217）、p-NF-κB p65 抗體（貨號ab95020）購于英國Abcam 公司；β 肌動蛋白（β-actin）抗體（批號161106）、辣根過氧化物酶（Horse reddish peroxidase，HRP）山羊抗兔／鼠（批號160913）購于北京中杉金橋生物技術有限公司；放射免疫沉淀法（Radio-Immunoprecipitation Assay，RIPA）裂解液（批號P0013B）購于上海碧云天生物研究所；白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA 試劑盒（批號20161021）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）（批號20161028）購于南京建成生物工程研究所；逆轉錄試劑盒（批號RR420 A）購于日本 Takara 公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量分析試劑盒（批號23225）購于美國Pierce 公司。

1.2 儀器 Gallios 型號流式細胞儀購于美國Beckman Coulter 公司；CFX384 型號實時定量PCR 儀購于美國Bio-Rad 公司；MK3 型號酶標儀購于美國Thermo 公司；GelDoc XR+型號購于美國Bio-Rad 公司；TS100-F 型號倒置顯微鏡購于日本尼康公司；XSP-9CA 型號光學顯微鏡購于上海光學儀器廠。

2 方法

2.1 細胞、培養(yǎng)與分組 將來自于美國ATCC 細胞庫的人類風濕性關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞株HFLS-RA 解凍復蘇后，接種于含15% 胎牛血清、100 μg／mL 鏈霉素和100 U／mL青霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，置于條件為37 ℃和5% CO2的細胞培養(yǎng)箱（日本SANYO 公司）中培養(yǎng)。每2 天換液1 次。待細胞融合度達85%時，胰蛋白酶消化，并按1 ∶3 比例傳代至第4 代時進行后續(xù)實驗。實驗分為5 組，分別為對照組（未處理）、誘導組（給予20 ng／mL TNF-α 處理）、25 μmol／L 大黃素組（給予20 ng／mL TNF-α 和25 μmol／L 大黃素共同處理）、50 μmol／L大黃素組（給予20 ng／mL TNF-α 和50 μmol／L 大黃素共同處理）和100 μmol／L 大黃素組（給予20 ng／mL TNF-α 和100 μmol／L大黃素共同處理）。每組設置3 個重復。

1.3 MTT 法檢測 取對數(shù)生長期的HFLS-RA 細胞以每孔5 000 個細胞接種至含完全培養(yǎng)基的96 孔細胞板上，于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)過夜。根據(jù)“1.2”項下分組給藥干預24 h。每個處理設置6 個平行孔。干預結束后，取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)液后加入質量濃度為5 g／L MTT 溶液20 μL 干預4 h。以200 μL二甲基亞砜溶解MTT 結晶物后，采用美國Thermo公司的酶標儀檢測各處理組細胞在450 nm 處的光密度值（OD 值）。按照公式細胞存活率＝（OD 值藥物組／OD 值對照組）×100%計算各組細胞的存活率。實驗重復3 次。

2.2 克隆形成實驗 取干預24 h 后的HFLS-RA 細胞，以每皿300 個細胞接種至60 mm 培養(yǎng)皿中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 d 后，吸去培養(yǎng)基以磷酸緩沖液沖洗。沖洗2 次后，加入預冷的4%甲醇溶液。待固定10～15 min 后，經磷酸緩沖液洗滌后，加入0.1% Giemsa 溶液。待染色15～30 min 后，流水沖洗晾干。置于顯微鏡下觀察統(tǒng)計克隆細胞數(shù)。其中，大于50 個細胞的集落記為有效克隆，以克隆形成率＝（克隆細胞數(shù)／接種細胞株）×100% 的公式計算各組細胞的克隆形成能力。實驗重復3 次。

2.3 流式細胞儀檢測 將干預24 h 后的HFLS-RA 細胞以胰蛋白酶消化制備細胞懸液。取細胞懸液1 mL，經磷酸緩沖液洗滌和離心后，重懸于200 μL 的結合緩沖液中，加入5 μL 膜聯(lián)蛋白V-FITC（Annexin V-FITC）和10 μL 碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）避光條件下染色15 min 后，補加300 μL 的結合緩沖液，上美國Beckman Coulter 公司的流式細胞儀進行檢測。實驗重復3 次。

2.4 RT-PCR 檢測 收集待檢測的HFLS-RA 細胞，采用Trizol 法提取總RNA，并采用分光光度法檢測總RNA 的質量。再按照逆轉錄試劑盒說明書步驟將RNA 反轉錄為cDNA。將由中國Invitrogen 公司合成的B 細胞淋巴瘤／白血病-2（B cell lymphoma／lewkmia-2），Bcl-2 引物（正向5′-GGTGGGGTCATGTGTGTGG-3′ 和反向 5′-CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC-3′）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 Associated X Protein），Bax 引物（正向5′-GCGCTCGTGTTTCTGGACA-3′和反向5′-AGTATAGACACTCGTCACTGGTG-3′）和β-actin引物（正向5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACACC-3′和反向5′-CATGGTGGTGCCGCCAGACAG-3′）加入二乙基焦磷酰胺（diethyl pyrocarbonate，DEPC）處理水稀釋成終濃度為0.4 μmol／L的工作液，取1 μL cDNA、各1 μL 正反引物、10 μL 2×SYBR Premix Ex TaqⅡ和7.4 μL ddH2O 配成20 μL的PCR 反應體系，放入PCR 儀中，按照95 ℃ 120 s、（95 ℃30 s、60 ℃30 s、72 ℃30 s）×40 個循環(huán)的PCR 擴增條件進行擴增，以β-actin 作為管家基因，2-△△CT法分析Bcl-2 和Bax mRNA 的相對表達水平。實驗重復3 次。

2.5 ELISA 法檢測上清液中IL-6 和IL-1β 水平 取含高糖培養(yǎng)基的6 孔細胞板，將生長良好的HFLS-RA 細胞以每孔3×105個細胞接種，放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按“2.1”項下的分組給藥處理，每組設置3 個復孔。處理24 h 后，收集各處理組上清液，參照ELISA 試劑盒說明書步驟分別檢測IL-6 和IL-1β 水平。實驗重復3 次。

2.6 Western blot 檢測 向待測的HFLS-RA 細胞中加入含蛋白酶抑制劑的蛋白質裂解液提取總蛋白。向經BCA 法定量后的總蛋白中加入等體積上樣緩沖液于沸水浴中變性3～5 min。取變性蛋白60 μg 行聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳分離。待完全分離后，電轉于聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。浸于新鮮的含5% 脫脂奶粉的TBST（Tris-HCl 緩沖鹽溶液+Tween）溶液溫育1 h 后，放入TBST 溶液稀釋1 000 倍的一抗中于4 ℃下孵育24 h。經TBST 溶液洗膜3 次，10 min／次，放入TBST 溶液稀釋5 000倍的二抗中37 ℃下孵育1 h。避光下加入化學發(fā)光劑顯影曝光后，采用美國Bio-Rad 公司的凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。實驗重復3 次。

3 結果

3.1 大黃素對HFLS-RA 細胞增殖的影響 MTT 檢測結果顯示，與對照組比較，誘導組細胞的存活率升高（P ＜0.05）；與誘導組比較，25、50、100 μmol／L 大黃素處理組細胞的存活率下降（P＜0.05）。同時，克隆形成實驗結果顯示，誘導組細胞的克隆形成率較對照組升高（P ＜0.05）；而給予25、50、100 μmol／L 大黃素處理后，HFLSRA 細胞的克隆形成率較誘導組均降低（P＜0.05）。隨著大黃素濃度的增加，HFLS-RA 細胞的存活率和克隆形成率越低。見表1。

表1 各組細胞的存活率、克隆形成率和凋亡率（，%，n＝9）

表1 各組細胞的存活率、克隆形成率和凋亡率（，%，n＝9）

注：與對照組比較，?P＜0.05；與誘導組比較，＃P＜0.05。

3.2 大黃素對HFLS-RA 細胞凋亡的影響 流式細胞儀（圖2）檢測對照組、誘導組、25 μmol／L 大黃素組、50 μmol／L大黃素組和100 μmol／L 大黃素組細胞的凋亡率存在差異（P＜0.05），與對照組比較，誘導組細胞的凋亡率降低（P＜0.05）；與誘導組比較，25、50、100 μmol／L大黃素組細胞的凋亡率均升高（P＜0.05），且呈濃度依賴性。結果見圖1、表1。

圖1 流式細胞儀檢測各組HFLS-RA 細胞的凋亡

3.3 大黃素對HFLS-RA 細胞凋亡相關基因表達的影響RT-PCR 檢測結果顯示，誘導組細胞中Bcl-2 mRNA 的表達水平高于對照組（P＜0.05），而Bax mRNA 表達低于對照組（P＜0.05）；隨25、50、100 μmol／L 大黃素濃度的升高，HFLS-RA 細胞中Bcl-2 mRNA 逐漸降低，而Bax mRNA 表達逐漸升高，與誘導組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見表2。

3.4 大黃素對HFLS-RA 細胞上清液中IL-6 和IL-1β 水平的影響 與對照組比較，誘導組中IL-6 和IL-1β 水平升高（P＜0.05）；而大黃素組較誘導組降低（P＜0.05），且大黃素濃度越高降低幅度越明顯。見表3。

表2 各組細胞中Bcl-2 和Bax mRNA 的相對表達水平（，n＝9）

表2 各組細胞中Bcl-2 和Bax mRNA 的相對表達水平（，n＝9）

注：與對照組比較，?P＜0.05；與誘導組比較，＃P＜0.05。

3.5 大黃素對HFLS-RA 細胞中NF-κB 信號通路的影響與對照組比較，誘導組細胞中p-IκBα 和p-NF-κB p65 蛋白的表達升高（P ＜0.05）；與誘導組比較，25、50、100 μmol／L大黃素組細胞中p-IκBα 和p-NF-κB p65 蛋白的表達下降（P＜0.05），且呈濃度依賴性。見圖2、表4。

表3 各組HFLS-RA 細胞上清液中IL-6 和IL-1β 水平（，n＝9）

表3 各組HFLS-RA 細胞上清液中IL-6 和IL-1β 水平（，n＝9）

注：與對照組比較，?P＜0.05；與誘導組比較，＃P＜0.05。

圖2 Western blot 檢測p-IκBα 和p-NF-κB p65 蛋白的表達

表4 各組HFLS-RA 細胞中p-IκBα 和p-NF-κB p65 蛋白的相對表達量（，n＝9）

表4 各組HFLS-RA 細胞中p-IκBα 和p-NF-κB p65 蛋白的相對表達量（，n＝9）

注：與對照組比較，?P＜0.05；與誘導組比較，＃P＜0.05。

4 討論

從中醫(yī)角度講，RA 是一種因風、寒、濕邪入侵導致的氣血凝滯和經絡痹阻的肢體關節(jié)病變，關節(jié)腫脹壓痛是急性活動期的重要表現(xiàn)。有報道［10］指出，中藥復方大黃散可通過緩解RA 關節(jié)的紅腫熱痛改善RA 病情，而其中的君藥大黃是我國傳統(tǒng)的中草藥，具有逐瘀通經之功效。此外，作為大黃的主要成分，大黃素是一種蒽醌類化合物，具有抗炎、免疫調節(jié)、抗病毒和抗腫瘤等藥理作用。已有研究［11-12］證實，大黃素可通過Notch-1／Hes 信號通路促進胰腺細胞凋亡進而減輕胰腺炎反應；另外，在LPS 刺激的小膠質細胞中，還可通過AMPK／Nrf2 信號通路發(fā)揮抗神經炎癥的作用。

TNF-α 是參與滑膜炎癥反應的重要細胞因子，貫穿RA的整個病程，其作為一種促炎因子，可通過激活巨噬細胞、中性粒細胞和單核細胞等參與免疫調節(jié)，也可通過誘導成纖維樣滑膜細胞和軟骨細胞產生炎癥介質，在觸發(fā)RA 炎癥反應和關節(jié)破壞等過程中發(fā)揮著重要作用。有研究［13-14］指出，TNF-α 可誘導RA 滑膜細胞增殖，抑制其凋亡并激活NF-κB 信號通路。NF-κB 信號通路是與炎癥反應關系密切的信號轉導通路，NF-κB p65 是NF-κB 家族中的重要成員，正常情況下，NF-κB p65 與p50 形成的二聚體與NF-κB 抑制蛋白IκB 結合成為無活性的復合物，但當受到外界刺激時，IκB 降解使NF-κB p65／p50 暴露出來，導致NF-κB 活化，其活化后可通過誘導促炎因子如IL-6 和IL-1β 的生成加重炎癥反應［15］，還可引發(fā)RA 滑膜細胞增殖和凋亡異常等反應，參與RA 發(fā)生發(fā)展［16］。本研究以TNF-α 刺激體外培養(yǎng)的人類風濕性關節(jié)炎成纖維樣滑膜HFLS-RA 細胞24 h后發(fā)現(xiàn)，HFLS-RA 細胞的存活率、克隆形成率、 Bcl-2 mRNA 的表達水平、p-IκBα 蛋白和p-NF-κB p65 蛋白的表達水平和上清液中IL-6、IL-1β 含量均明顯升高，細胞凋亡率和Bax mRNA 的表達降低；而給予25、50 和100 μmol／L大黃素干預后，TNF-α 引起的上述變化均明顯受到顯著抑制，且呈濃度依賴性。 Bcl-2 和Bax 是與細胞凋亡關系密切的抑凋亡因子和促凋亡因子，在RA 患者中Bcl-2 表達升高而Bax 表達降低，通過活化抑制RA 滑膜細胞調亡信號，促進細胞增殖［13，17］。已有報道［18-19］證實，大黃素可抑制NFκB 信號通路的活化改善缺氧和脂多糖誘導的腸上皮屏障功能障礙，而NF-κB 信號通路受到抑制可降低舌鱗癌移植瘤細胞中Bcl-2 和上調Bax。結果提示，大黃素可通過抑制NF-κB 信號通路的活化抑制HFLS-RA 細胞增殖，誘導細胞凋亡，減輕炎癥反應。

綜上所述，大黃素可抑制RA 滑膜細胞增殖，誘導細胞凋亡，減輕炎癥反應，其分子機制可能與抑制NF-κB 信號通路的活化有關。該結果為大黃素臨床治療RA 提供新依據(jù)。然而，大黃素是否通過調控其他信號通路或基因的表達發(fā)揮抗RA 的作用還有待后續(xù)進一步研究。