癲癇清顆粒對阿爾茨海默病模型小鼠血腦屏障的影響

李 熒，楊彩瑜，賈 冬，明彩榮，齊 越?

（1.遼寧中醫藥大學研究生學院，遼寧沈陽 110847；2.遼寧中醫藥大學附屬第二醫院，遼寧沈陽 110034）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種以β-淀粉樣蛋白（Aβ）異常沉積、tau 蛋白過度磷酸化和神經纖維纏結為主要病理特征的中樞神經退行性疾病，主要表現為學習記憶能力減退和認知功能障礙。血腦屏障由腦微血管內皮細胞、內皮細胞間的緊密連接、星形膠質細胞終足和周細胞組成。研究表明，AD 患者存在血腦屏障損傷［1］。Aβ 作為一種公認的與AD 病理相關的小分子肽，體外研究顯示Aβ25-35能夠破壞血腦屏障緊密連接結構，引起血腦屏障滲漏［2］。當血腦屏障結構和功能的完整性出現缺失時，會引起中樞與外周分子交換異常、神經元與神經膠質細胞受損、血管氧化應激［3］、腦微血管Aβ 沉積增加等［4］，可能會進一步加劇認知功能障礙。

Sigma-1 受體（σ1R）廣泛存在于中樞神經系統的神經元、神經膠質細胞和相關的免疫和內分泌組織中。多種研究表明，σ1R 在改善AD 模型動物學習記憶能力方面表現出積極的作用。癲癇清顆粒是臨床經驗處方，具有豁痰息風、活血化瘀、開竅益智的功效。本研究利用Aβ25-35致AD小鼠模型，并給予癲癇清顆粒和σ1R 拮抗劑，觀察癲癇清顆粒對于AD 模型小鼠血腦屏障功能的影響及其相關機制，旨在為AD 防治提供更廣泛的理論基礎。

1 材料

1.1 動物 96 只SPF 級ICR 雄性小鼠，體質量為20～24 g，購于遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號SYXK（遼）2013-0009。

1.2 藥物與試劑 癲癇清顆粒（遼寧中醫藥大學附屬第二醫院，批號20140110，生藥含量為5.31 g／g）；鹽酸多奈哌齊片［衛材（中國）藥業有限公司，5 mg／片，批號140 606 A］；Aβ25-35（美國Sigma 公司，貨號A4559，批號038M4822 V）；BD1047（TOCRIS 公司，貨號138356-21-5，批號4A／219731）；EB（伊文斯藍，上海瑞永生物科技有限公司，貨號RS1049-5 g，批號RS18B1116）；鼠抗膠質纖維酸性蛋白（GFAP，北京博奧森生物技術有限公司，貨號bsm-33065 M，批號AH03099387）；兔抗血管內皮生長因子（VEGF，北京博奧森生物技術有限公司，貨號bs-1313R，批號AB9071709）；TRIzol（武漢谷歌生物科技有限公司，批號171025）；逆轉錄試劑盒（悠揚生物科技有限公司，貨號RT-01001，批號095634）；Cx43、 occludin 引物由華大基因生物科技有限公司提供；實時定量PCR 擴增預混合液［2×SYBR qPCR Master Mix（Universal）］（悠揚生物科技有限公司，貨號R-01001，批號190601）。

1.3 儀器 DW-200 型腦立體定位儀（成都泰盟科技公司）；微量進樣器（上海安亭微量進樣器廠，規格10 μL）；Y 迷宮（遼寧中醫康復中心）；MT-200 型Morris 水迷宮（成都泰盟科技公司）。

2 方法

2.1 分組 96 只雄性小鼠適應性飼養1 周，按體質量隨機分為假手術組、模型組、癲癇清顆粒組、鹽酸多奈哌齊組、BD1047 組和癲癇清+BD1047 組，每組16 只。

2.2 造模 350 mg／kg 水合氯醛麻醉小鼠后，固定，剪毛，碘伏、酒精消毒頭部皮膚。切開小鼠頭部皮膚約2 cm，找到囟門位置，以囟門為原點，向右移動1 mm，向后移動0.5 mm，深度為3 mm，微量進樣器緩慢注射3 μL 老化的Aβ25-35，彌散5 min。消毒后傷口處涂抹適量青霉素鈉粉末，縫合傷口，涂抹火棉膠。置于鼠籠中飼養，注意術后保暖。假手術組注射等體積無菌生理鹽水。

2.3 給藥 造模第2 天開始灌胃給藥癲癇清顆粒（12.48 g／kg，按生藥量計，每克含有5.31 g 生藥）和鹽酸多奈哌齊（1.3 mg／kg），給藥量為20 mL／kg，拮抗劑BD1047（1 mg／kg），為腹腔注射給藥，每日1 次，連續給藥21 d，各組動物無死亡，小鼠狀態良好。假手術組和模型組小鼠灌胃等體積蒸餾水并腹腔注射等體積無菌生理鹽水。

2.4 Y 迷宮實驗 Y 迷宮可用于評估小鼠的短期記憶能力［5］，第15 天給藥結束后1 h 對所有實驗動物進行Y 迷宮實驗。Y 迷宮裝置由長40 cm、寬15 cm、上口9 cm、下底5 cm 的3 個互為120 °夾角的木質支臂組成，依次標為A、B、C。將小鼠放在Y 迷宮交叉點，任其自由探索8 min，記錄小鼠進入3 個臂的總次數（N）和進臂順序。以連續進入3 個不同支臂為1 次正確交替反應，記錄正確交替反應次數。用自發交替反應率反映實驗動物的空間工作記憶能力。自發交替反應率＝正確交替反應次數／（N-2）×100%［6］。

2.5 水迷宮定位航行實驗 對所有動物進行水迷宮實驗。Morris 水迷宮定位航行實驗考察動物空間學習的記憶能力。Morris 水迷宮為直徑80 cm、高33 cm 的白色圓桶狀裝置。將水迷宮裝置分為4 個等面積的扇形區域，分別記為第一至四象限。平臺為俯視圓形，側視工形的白色金屬裝置。平臺位于第一象限扇形區域中間位置。桶內裝水，水中混勻可食用白色素掩蓋平臺位置，保持水面高于平臺1 cm。第16 天給藥結束后1 h 所有實驗小鼠進行Morris 水迷宮定位航行實驗。將小鼠面壁腹部朝內放入水中，1 min 內小鼠從入水到登上平臺的時間為潛伏期。若小鼠在1 min 內未能成功登臺，則潛伏期為60 s。每天游泳2 次，間隔4 h，連續游泳5 d。

2.6 伊文斯藍滲漏實驗 空間探索實驗結束后，在每組動物中隨機選取6 只小鼠，尾靜脈注射2%的伊文斯藍溶液（4 mL／kg），全身循環3 h 后，用350 mg／kg 水合氯醛麻醉，心臟灌流生理鹽水至流出液體透明為止，斷頭取腦，稱量大腦濕重。將大腦置于有錫紙包裹的離心管中，每例樣本加入3 mL 甲酰胺，剪碎大腦，45 ℃水浴孵育72 h 后離心取上清。酶標儀（632 nm）測定吸光度值。

將伊文思藍溶解于甲酰胺中，終質量濃度分別為8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg／mL，45 ℃避光水浴72 h?？瞻卓诪榈润w積甲酰胺溶液，酶標儀（632 nm）測定吸光度，制作標準曲線。根據標準曲線計算每克腦組織含伊文斯藍的質量（μg／g）。

2.7 免疫組化染色檢測VEGF、GFAP 表達 空間探索實驗結束后，在每組動物中隨機選取6 只小鼠制備常規石蠟切片，切片經過脫蠟水化、內源性過氧化氫酶滅活后，進行抗原修復、封閉、4 ℃孵育一抗過夜。次日PBS 沖洗、孵育生物素化二抗，DAB 染色，蘇木素復染。中性樹膠封片。顯微鏡鏡下觀察目標抗原表達。每只小鼠各取10 張冠狀切片，每張切片隨機選取5 個不同的視野。陽性結果為細胞內表達棕黃色顆粒。用JEOA 801D 形態學圖像分析系統，計算各組陽性細胞平均光密度值。

2.8 Cx43、 occludin mRNA 檢測 每組動物隨機選取4 只小鼠，用TRIzol 法提取皮層組織總RNA，使用紫外吸收測定法、變性瓊脂糖凝膠電泳法測定總RNA 濃度和純度。濃度和純度測定結束后，進行逆轉錄反應，反應1，5×gDNase Mix 2.0 μL，Template（RNA）5 μL，RNase-Free ddH2O 3 μL，42 ℃2 min，4 ℃+∞；反應2，反應液1 取10 μL，5×RO-Easy Mix 4 μL，RNaseFree ddH2O 6 μL，37 ℃15 min，85 ℃5s，4 ℃+∞；將cDNA 配置于Realtime quantitative PCR 反應體系中。cDNA 0.4 μL，正向引物（10 μmol／L）0.4 μL，反向引物（10 μmol／L）0.4 μL，2×SYBR Green Fast qPCR Mix with Low Rox 10 μL，ddH2O 8.8 μL，95 ℃2 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min，72 ℃1 min，40 cycles；95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s，60 ℃15 s。得到Ct值，以β-actin 作為內參基因進行校準，以2-△△Ct進行分析。引物序列，Cx43 正向（5′to 3′）CTAGGTGTGGATGGACCTTATG，反 向（5′ to 3′）ATCATTTGGTGAGGGTGAGG；occludin 正向（5′to 3′）GCCCTCAGGTGACTGTTATTTA，反向（5′ to 3′）CTGCCTTAGTTTCA GTTTG；β-actin-正 向（5′ to 3′）GTCCCTCACCCTC CCAAAAG，反向（5′to 3′）GCTGCCTCAACACCTCAACCC。

2.9 統計學分析 采用SPSS 17.0 軟件進行數據分析，實驗結果以（）表示，多組間比較單因素方差分析或雙因素方差分析，以P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 Y 迷宮實驗 Y 迷宮用于評估空間識別記憶能力，各組小鼠進入支臂總次數無差異，說明癲癇清顆粒對小鼠自發活動沒有明顯影響。與假手術組比較，模型組自發交替反應率下降（P＜0.05）；與模型組比較，癲癇清顆粒組和鹽酸多奈哌齊組自發交替反應率增加（P＜0.05），BD1047組和癲癇清+BD1047 組自發交替反應無差異。見圖1。

圖1 癲癇清顆粒對AD 小鼠Y 迷宮實驗的影響（，n＝16）

3.2 水迷宮定位航行實驗 水迷宮前3 天各組小鼠游泳潛伏期無差異；第4 天，與假手術組比較，模型組小鼠游泳潛伏期增加（P＜0.01）；與模型組比較，癲癇清顆粒組和鹽酸多奈哌齊組小鼠游泳潛伏期縮短（P＜0.01，P＜0.05），BD1047 組和癲癇清+BD1047 組潛伏期比較模型組雖有降低，但差異無統計學意義；第5 天，與假手術組比較，模型組游泳潛伏期增加（P＜0.01）；與模型組比較，癲癇清顆粒組和鹽酸多奈哌齊組潛伏期縮短（P＜0.01），BD1047組和癲癇清+BD1047 組潛伏期相比模型組雖有降低，但差異無統計學意義。見圖2。

圖2 癲癇清顆粒對AD 小鼠潛伏期的影響（，n＝16）

3.3 伊文斯藍滲漏實驗 與假手術組比較，模型組伊文思藍的含量增加（P＜0.01）；與模型組比較，癲癇清顆粒組和鹽酸多奈哌齊組的伊文斯藍滲漏量減少（P ＜0.01），BD1047 組和癲癇清+BD1047 組的伊文斯藍滲漏量與模型組比較差異無統計學意義。見表1。

表1 各組AD 小鼠腦組織伊文斯藍含量（，n＝6）

表1 各組AD 小鼠腦組織伊文斯藍含量（，n＝6）

注：與假手術組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.4 GFAP 和VEGF 免疫組化染色 與假手術組比較，模型組小鼠海馬區域GFAP 表達增多（P＜0.01），VEGF 表達減少（P＜0.01）；與模型組比較，癲癇清顆粒組和鹽酸多奈哌齊組海馬區域GFAP 陽性表達降低（P＜0.01），VEGF陽性表達增加（P＜0.01，P＜0.05）；BD1047 組和癲癇清+BD1047 組的GFAP 和VEGF 表達與模型組比較差異無統計學意義。見圖3～4、表2。

表2 各組小鼠海馬組織中GFAP 和皮質中VEGF 的表達（，n＝6）

表2 各組小鼠海馬組織中GFAP 和皮質中VEGF 的表達（，n＝6）

注：與假手術組比較，??P ＜0.01；與模型組比較，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

圖3 各組小鼠海馬組織GFAP 表達（ICH，×400）

圖4 各組小鼠皮質部位VEGF 表達（ICH，×400）

3.5 癲癇清顆粒對AD 小鼠皮層Cx43、 occludin mRNA 的影響 與假手術組比較，模型組小鼠皮層Cx43、 occludin mRNA 表達降低（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組比較，癲癇清顆粒組Cx43、 occludin mRNA 的表達升高（P＜0.01），BD1047 組Cx43、 occludin mRNA 表達雖有增加，但差異無統計學意義；癲癇清顆粒+BD1047 組Cx43 mRNA 表達，與模型組比較，差異無統計學意義，但occludin mRNA 表達增加（P＜0.05）。見圖5。

4 討論

Zlokovic 等［7］首次提出了AD 的神經血管假說，該假說認為Aβ 在血腦屏障清除的障礙，異常血管生成和腦血管系統的老化可能會引發神經血管退化、腦灌注不足和神經血管炎癥，最終導致血腦屏障損傷、內環境失衡以及突觸和神經元功能損傷和喪失。保護血腦屏障結構與功能的完整性是改善AD 病理的可能途徑之一。

圖5 癲癇清顆粒對AD 小鼠皮層Cx43、 occludin mRNA 的影響（，n＝4）

腦微血管內皮細胞通過緊密連接結構相互聯系是構成血腦屏障的基礎。緊密連接結構包括occludin、連接黏附分子（Junction adhesion molecule，JAM）、claudins 和胞質附著蛋白（ZO-1、ZO-2 和ZO-3），其中occludin 是緊密連接結構的主要組成部分［8］。星形膠質細胞作為血腦屏障的重要組成部分，對于調節突觸功能、參與腦能量代謝［9］和維持神經元生長等具有重要意義。縫隙連接蛋白43（Cx43）作為星形膠質細胞之間的主要連接蛋白，與血腦屏障通透性密切相關［10］。AD 發生時常伴隨著occludin 及Cx43 等多種連接蛋白的丟失和分布異常，星形膠質細胞的過度活化，神經元損傷加重以及血腦屏障的通透性增加［11］。GFAP 是星形膠質細胞的特異性標志物，且在星形膠質細胞活化狀態下表達增加。VEGF 主要由星形膠質細胞產生，可特異性的促進血管內皮細胞有絲分裂，參與血管形成［12］。研究表明，AD 中VEGF 含量顯著降低［13］；增加VEGF 可降低血腦屏障通透性［14］，較高的VEGF 水平與記憶改善相關［15］。

癲癇清顆粒處方由石菖蒲（Acorus tatarinowii Schott.）、膽南星（Arisaema cum Bi）、紅花（Carthamus tinctorius L.）等11 味中藥組成。前期研究結果顯示，癲癇清顆?？赏ㄟ^減少BACE1、PS1 的蛋白表達，抑制Aβ 的生成［16］，保護海馬神經元［17］，進而改善AD 模型動物的學習記憶障礙。在本研究中，AD 模型小鼠VEGF、 Cx43 和occludin mRNA表達顯著降低，GFAP 水平顯著升高，伊文斯藍滲漏增加，提示血腦屏障受損。癲癇清顆粒給藥干預后，小鼠VEGF、occludin 和Cx43 mRNA 表達顯著升高，GFAP 水平顯著降低，伊文斯藍向腦實質滲漏減少，說明癲癇清顆粒可能通過調節腦內VEGF 水平；增加血腦屏障中連接蛋白的表達；抑制星形膠質細胞過度活化，維護血腦屏障功能，進而發揮抗AD 的作用。

σ1R 主要定位于內質網和線粒體相關的內質網膜（MAM），激活時，可通過調節離子通道、蛋白激酶和G 蛋白偶聯受體發揮作用［18］。在本研究中，課題組給予AD 模型小鼠σ1R 拮抗劑BD1047 后發現，BD1047 組連接蛋白表達降低，膠質細胞活性增強，說明σ1R 與AD 模型血腦屏障功能有關聯。癲癇清顆粒和BD1047 聯合用藥后，與模型組比較，星型膠質細胞活性、血腦屏障通透性及連接蛋白表達，差異無統計學意義，說明癲癇清顆?？赏ㄟ^σ1R 降低AD 模型小鼠的血腦屏障通透性，改善其學習記憶能力，發揮抗AD 的作用。