枯草芽孢桿菌JLGA-SD-28 轉化人參皂苷Rb1 的特性及其全基因組測序分析

趙彩秀 王 楠 黃 鑫越 皓郭云龍?劉淑瑩

（1.長春中醫藥大學，吉林長春 130117；2.中國科學院長春應用化學研究所，吉林長春 130022）

人參Panax ginseng C.A.Mey 是我國乃至世界的名貴中藥材之一，具有極高的藥用價值及保健功能，特別是在2002 年人參被批準為新資源食品，人參食品相關的基礎研究和產品開發成為熱點［1］。人參具有大補元氣、養血生津、保護心肌、疏通筋脈的功效［2］。人參皂苷是人參的主要活性成分，分為達瑪烷型四環三萜類原人參二醇型皂苷、達瑪烷型四環三萜類原人參三醇型皂苷、齊墩果烷型五環三萜類皂苷及奧克梯隆型皂苷［3-4］。相關的藥理活性研究表明，人參皂苷具有抗病毒、抗衰老、抗腫瘤、改善認知功能、抗心律失常等作用［5-7］。人參皂苷的代謝研究證實了進入機體起作用的是經過胃腸道菌群代謝后的代謝產物次級皂苷，這些次級皂苷通常被稱為稀有人參皂苷，具有相對較高的生理活性和藥理作用，更容易被機體吸收［8-9］。人參皂苷Rg3 具有抗腫瘤、抗糖尿病、抗抑郁、抗炎、增強機體免疫力等作用［10-11］。人參皂苷CK 具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗抑郁等作用［12-14］。稀有人參皂苷在人參中含量相對較低，甚至有些稀有人參皂苷根本不存在，直接制備和純化成本較高，系統研究稀有人參皂苷轉化具有一定的理論意義和市場需求。

現階段稀有人參皂苷的轉化方法主要有化學轉化法、微生物轉化法和酶轉化法［15］。化學轉化法反應條件劇烈，副產物多，易造成環境污染［16］。微生物轉化法的微生物來源比較廣泛、種類繁多、更容易獲得，微生物轉化反應速度快、成本低［17-18］。酶轉化法反應條件溫和，轉化效率高，無環境污染［19］。其中生物轉化通過對人參皂苷上的糖基進行結構改造來制備出活性較高的稀有人參皂苷的研究成為國內外人參皂苷研究的熱點［20］。Zhou 等［21］研究發現，人參皂苷Rb1 可通過Paecilomyces bainier sp. 229 轉化為人參皂苷CK 以及1 個已知的3-酮衍生物和2 個新的脫氫代謝物，并探討了其對Wnt 信號通路的作用機制。李俊瑩等［22］研究表明，人參內生真菌Burkholderia sp.GE 17-7 能夠特異性水解原人參二醇型皂苷C-20 位糖基，制備人參皂苷Rg3。

人參皂苷轉化產物一般通過薄層色譜檢測，但其靈敏度較低。超高效液相色譜與高分辨質譜相聯用技術具有耗時少、分辨率高、特異性強和靈敏度高等特點，能夠進行更加準確可靠的分析，但其缺點成本較高［23-24］。

前期實驗以人參莖葉總皂苷為碳源，富集土壤中的微生物，經分離、純化后，得到30 種可轉化稀有人參皂苷的微生物，經過測序確定JLGA-SD-28 為枯草芽孢桿菌。本實驗將枯草芽孢桿菌JLGA-SD-28 作為發酵底物進行進一步分析研究，以人參皂苷Rb1 為轉化底物，通過振蕩培養后，采用UHPLC-Q-Exactive 四級桿-靜電場軌道阱高分辨液質聯用技術對轉化前后的底物和產物進行檢測，闡明枯草芽孢桿菌JLGA-SD-28 轉化人參皂苷Rb1 的途徑，并且通過全基因組測序，確定其功能特性。

1 材料

1.1 試劑 枯草芽孢桿菌JLGA-SD-28 為本實驗室前期從土壤中篩選得到，經長春中醫藥大學王淑敏教授鑒定為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis；人參皂苷Rb1 標準品（純度＞98%，上海源葉生物科技有限公司，批號Z20S9X70603）；人參皂苷Rg5 標準品（純度＞98%，上海源葉生物科技有限公司，批號B24M8S32390）；人參皂苷Rg3 標準品（純度＞98%，上海源葉生物科技有限公司，批號Z25J9X64237）；人參皂苷CK 標準品（純度＞98%，上海源葉生物科技有限公司，批號Y20N9Z75484）；人參皂苷Rk1 標準品（純度＞98%，上海源葉生物科技有限公司，批號B27J8S39859）；乙腈（色譜純，美國Fisher 公司，批號184266）；甲醇（色譜純，美國Fisher 公司，批號186346）；超純水（Dura series 超純水處理系統）。

1.2 儀器 立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；全溫搖床（上海智誠分析儀器制造有限公司）；DZF-6050 真空干燥箱（上海申賢恒溫設備廠）；SWCJ-1D 型單人凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；Thermo Ultimate 3000 型超高效液相色譜系統、Thermo QExactive Orbitrap 質譜儀，包括Xcaliber 工作站（美國Thermo Fisher 公司）。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 培養基 LB 培養液（100 mL）、氯化鈉1 g、胰蛋白胨1 g、酵母粉0.5 g、5 mol／L 氫氧化鈉20 μL、蒸餾水定容至100 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

2.1.2 50 mmol／L 磷酸鹽緩沖液 A 液（pH 7.0），取二水合磷酸二氫鈉3.12 g，加蒸餾水定容至100 mL；B 液，取十二水合磷酸氫二鈉7.17 g，加蒸餾水定容至100 mL；取A 液39 mL 與B 液61 mL 混合，蒸餾水定容至400 mL。

2.1.3 轉化底物人參皂苷Rb1 溶液 取人參皂苷Rb1 10 mg，加無菌水定容至10 mL，即得。

2.2 稀有人參皂苷轉化 將枯草芽孢桿菌JLGA-SD-28 置于LB 培養液中，在37 ℃、200 r／min 條件下的搖床中培養24 h，得到該菌的菌液。取菌液8 mL，加入Rb1 底物皂苷溶液1 mL、磷酸鹽緩沖液1 mL，在37 ℃、200 r／min 條件下的搖床中培養4 d，得到人參皂苷轉化后的樣品。

2.3 人參皂苷轉化后樣品處理 在人參皂苷轉化后的樣品中加入等體積的水飽和正丁醇，渦旋震蕩1 min，在6 000 r／min的條件下離心5 min，取上清液，在45 ℃的水浴鍋中揮干后加入1 mL 甲醇溶解，得到待測樣品。

2.4 Thermo QE 液質聯用檢測

2.4.1 Thermo QE 液質聯用檢測色譜條件 SUPELCO C18色譜柱（5 cm×3.0 mm，2.7 μm）；流動相0.1% 甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0 min，15% B；5 min，19%B；10 min，19% B；13 min，25% B；15 min，28% B；18 min，28%B；22 min，30% B；25 min，35% B；30 min，40%B；35 min，60%B；38 min，80%B；40 min，100% B；45 min，100% B；50 min，15% B；60 min，15% B）；體積流量0.4 mL／min；進樣量5 μL；柱溫35 ℃。

2.4.2 Thermo QE 液質聯用檢測質譜條件 電噴霧離子源；負離子模式；噴霧電壓-3 kV；干燥氣溫度350 ℃；鞘氣流速40 L／min；輔助氣流速10 L／min；吹掃氣體積流量1 L／min；掃描方式為Full MS；質量掃描范圍m／z 100～1 500；質量分辨率70 000。

2.5 枯草芽孢桿菌JLGA-SD-28 菌種的全基因組測序、組裝、注釋 將枯草芽孢桿菌JLGA-SD-28 的基因組DNA 委托北京百邁客生物科技有限公司利用ONT 測序平臺以及Nanopore 測序平臺進行全基因組測序。利用Nanodrop、Qubit 和0.35%瓊脂糖凝膠電泳進行純度、濃度和完整性質檢，提取高質量基因組DNA；通過BluePippin 全自動核酸回收系統回收大片段DNA；SQK-LSK109 連接試劑盒進行文庫構建；上機測序。使用Canu v1.5 軟件［25］對過濾后subreads 進行組裝，最后采用Pilon［26］軟件利用二代數據進一步對組裝基因組進行糾錯，得到最終準確度更高的基因組。對重復序列、編碼基因、非編碼RNA、假基因、前噬菌體、基因島、CRISPR 進行基因組組分分析，得到預測基因。利用預測得到的基因序列與蛋白質直系同源簇（Cluster of Orthologous Groups of proteins，COG［27］）、非冗余蛋白（non-redundant database，Nr［28］）等功能數據庫做BLAST［29］比對，得到基因功能注釋結果。基于Nr 數據庫比對結果，應用軟件Blast2GO［30］進行基因本體（Gene Ontology，GO［31］）數據庫的功能注釋。利用已預測得到的基因組信息，如重復序列、鳥嘌呤和胞嘧啶所占的比率（GC含有量）等，應用軟件Circos［32］繪制基因組圈圖。另外，利用軟件hmmer［33］基于碳水化合物相關酶數據庫（Carbohydrate-Active enZymes，CAZy［34］）進行碳水化合物酶類基因的功能注釋。

3 結果

3.1 Thermo QE 液質聯用檢測結果 通過與標準品對比，確定其轉化產物，結果見圖1。

圖1 枯草芽孢桿菌JLGA-SD-28 轉化人參皂苷Rb1 總離子流圖

本實驗中，枯草芽孢桿菌JLGA-SD-28 可將人參皂苷Rb1 轉化為人參皂苷Rg3、Rk1、Rg5 以及絞股藍皂苷LXXV。推測人參皂苷Rb1 轉化途徑為人參皂苷Rb1 的C-3位糖苷鍵發生水解斷裂為絞股藍皂苷LXXV；人參皂苷Rb1的C-20 位糖苷鍵發生水解斷裂為人參皂苷Rg3，人參皂苷Rg3 的C-20 位發生脫水反應，生成人參皂苷Rk1 和人參皂苷Rg5，見圖2。

圖2 枯草芽孢桿菌JLGA-SD-28 轉化人參皂苷Rb1 途徑

3.2 枯草芽孢桿菌JLGA-SD-28 基因組功能 枯草芽孢桿菌JLGA-SD-28 的基因組全長為4 215 536 bp，GC 含有量為43.51%，基因組預測編碼了4 229 個開放閱讀框（ORFs），預測基因的平均長度為878 bp，其中假基因11 個，非編碼RNA 基因217 個，包括30 個rRNA、86 個tRNA 和101 個其他ncRNA。枯草芽孢桿菌JLGA-SD-28 的基因組圈見圖3。

圖3 基因組圈圖

3.3 基因組功能注釋

3.3.1 GO 功能注釋 GO 注釋分類統計結果見圖4。在枯草芽孢桿菌JLGA-SD-28 的GO 分析中，共有3 461 個基因被注釋，分生物過程（7 202）、分子功能（4 439）和細胞成分（6 302）3 類功能注釋結果，共包括43 種功能。在生物過程分類中，ORFs 數量最多的是代謝過程（1 820）、細胞過程（1 695）和單組織過程（1 547）。在分子功能分類中，催化活性（2 038）的ORFs 數量最多，其次是結合活性（1 567）。在細胞成分分類中，ORFs 數量最多的是細胞（1 796）和細胞部分（1 796），其次是膜（1 185）和膜部分（1 000）。

3.3.2 COG 功能注釋 COG 注釋分類統計結果見圖5。枯草芽孢桿菌JLGA-SD-28 的COG 功能注釋分類顯示注釋的3 097個ORFs 分為25 類，其中僅一般功能預測占比最大（13.98%），其次是氨基酸轉運和代謝（10.25%）、轉錄（9.06%）、功能未知（8.97%）、碳水化合物轉運和代謝（8.27%），RNA 加工和修飾、細胞外結構、核結構和細胞骨架沒有基因分布。

3.3.3 CAZy 功能注釋 CAZy 功能注釋中糖苷水解酶分析結果見表1，糖苷轉移酶分析結果見表2。通過CAZy 數據庫功能注釋結果，分析了枯草芽孢桿菌JLGA-SD-28 基因組中與糖苷水解酶以及糖苷轉移酶相關的基因。該菌共有108個基因與人參皂苷的轉化相關，其中有62 個基因與人參皂苷Rg3 和絞股藍皂苷LXXV 的轉化相關，可分為24 個不同的糖苷水解酶家族；有46 個基因與人參皂苷Rk1 和Rg5 的轉化相關，可分為12 個不同的糖苷轉移酶家族。

圖4 GO 功能注釋分類統計圖

圖5 COG 功能注釋分類統計圖

表1 CAZy 功能注釋糖苷水解酶分析表

表2 CAZy 功能注釋糖苷轉移酶分析表

4 結論

人參皂苷轉化過程中底物及產物的檢測，通常選用薄層色譜方法，但展開劑和顯色劑對人體危害較大，特別是氯仿，世界衛生組織國際癌癥研究機構公布的致癌物清單初步整理參考，氯仿在2B 類致癌物清單中，同時薄層色譜法其靈敏度和專屬性具有一定的局限性。本實驗通過超高效液相色譜與高分辨質譜聯用技術驗證了參地土壤所篩選出枯草芽孢桿菌JLGA-SD-28 具有較強的轉化人參皂苷Rb1的能力，進一步明確了其轉化途徑，其主要產物為人參皂苷Rg3、Rk1、Rg5 以及絞股藍皂苷LXXV，并且具有更強的抗腫瘤、降壓、抗炎等藥理活性［35］。

利用微生物法轉化人參皂苷，其本質是通過微生物生長不同時期所產生的酶，酶解人參皂苷元所連接不同的糖基團。本實驗通過全基因組測序技術對枯草芽孢桿菌JLGA-SD-28 進行分析，明確其基本的功能特性，進而發現與人參皂苷轉化的基因和糖基水解酶及糖苷轉移酶的具體數量。

本實驗確定了枯草芽孢桿菌JLGA-SD-28 對人參皂苷Rb1 的轉化途徑及產物，并且通過全基因組測序分析了具有人參皂苷轉化功能的基因，以期為后續研究該菌種對人參皂苷的轉化提供參考，也為該菌的酶學研究提供依據。