拳卷地錢(qián)乙醇提取物HPLC 指紋圖譜與其抗急性肝損傷的譜效關(guān)系

李平鳳，黎 理，謝鳳鳳，李 鵬，劉婧曦，趙 凌，龔登美，朱 華

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧 530001）

地錢(qián)又稱(chēng)地衣，喜生于陰濕之地，廣泛分布于全國(guó)各地，其藥用始載于《名醫(yī)別錄》，其味淡，性涼，歸肝經(jīng)，具有清熱利濕、解毒斂瘡之功效，主治濕熱黃疸、瘡癰腫毒、毒蛇咬傷、水火燙傷、骨折、刀傷等［1］。廣西境內(nèi)有地錢(qián) Marchantia polymorpha L.、粗裂地錢(qián) Marchantia paleacea Bert.、拳卷地錢(qián)Marchantia convoluta Gao et Chang3種地錢(qián)屬植物，以拳卷地錢(qián)為主，為廣西民間常用中草藥［2］，常用其外治燙傷骨折、體癬、潰瘍不愈合，內(nèi)治黃疸型肝炎，均取得良好效果［3］。

中藥化學(xué)成分復(fù)雜多樣，不同成分協(xié)同發(fā)揮藥效作用。在研究譜效關(guān)系時(shí)，需要將能展現(xiàn)中藥“有效組分群”的指紋圖譜與功效相結(jié)合來(lái)反映其中化學(xué)成分與藥效的內(nèi)在聯(lián)系，才能建立起中藥與藥效基本一致的、能全面反映產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［4-6］，但尚無(wú)拳卷地錢(qián)在該方面的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)建立了11 個(gè)產(chǎn)地的拳卷地錢(qián)乙醇提取物的HPLC 指紋圖譜，通過(guò)灰色關(guān)聯(lián)分析、多元線(xiàn)性回歸分析與其四氯化碳誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷保護(hù)作用的譜效關(guān)系，以期為該藥材用于衡量抗急性肝損傷保護(hù)作用的程度提供條件，對(duì)評(píng)價(jià)其內(nèi)部質(zhì)量具有重要意義。

1 材料

1.1 試劑與藥物 從廣西采集11 批拳卷地錢(qián)（編號(hào)A1～A11），經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定為拳卷地錢(qián)Marchantia convoluta Gao et Chang，具體信息見(jiàn)表1。芹菜素對(duì)照品（20 mg，純度99.2%，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111901-201603）。吐溫-80 購(gòu)自天津富宇精細(xì)化學(xué)試劑有限公司；CCl4、水合氯醛均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聯(lián)苯雙酯滴丸（1.5 mg × 250 丸／瓶，批號(hào)A02150123，日用量22.5～45 mg）購(gòu)于萬(wàn)邦德制藥集團(tuán)股份有限公司；ALT／GPT 試劑盒（批號(hào)180915）、AST 試劑盒（批號(hào)180811）均購(gòu)自南京建生物工程有限公司。甲醇、乙腈為色譜純（美國(guó)Fisher 公司）；甲醇、95% 乙醇、無(wú)水乙醇為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；冰乙酸為色譜純（天津大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)）。

表1 樣品信息

1.2 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀，配置G-1311C四元泵、二極管陣列檢測(cè)器、Agilent 1260 series 色譜工作站（美國(guó)安捷倫科技公司）；KQ-5200 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；電子分析天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；HH-A6 數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠(chǎng)）；TGL-16G 型高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)）；Millipore Direct-Q3，5，8 純水／超純水一體機(jī)（德國(guó)默克公司）；5810R 低溫冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；動(dòng)物電子天平（美國(guó)雙杰公司）。

1.3 動(dòng)物 SPF 級(jí)健康SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，由湖南斯柯達(dá)生物科技股份有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2016-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)43004700050126，于通風(fēng)、清潔、安靜、溫濕度適宜的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，其間自由飲水進(jìn)食。

2 方法與結(jié)果

2.1 乙醇提取物制備 取11 批前期處理好的藥材。按照文獻(xiàn)［7］報(bào)道的方法進(jìn)行提取。250 g 樣品用80%乙醇回流提取3 次，每次0.5 h，料液比為1 ∶15，過(guò)濾合并濾液，減壓蒸餾回收乙醇，蒸至約400 mL 后轉(zhuǎn)入蒸發(fā)皿，蒸至浸膏狀，即得。再采用萃取硅膠柱層析法純化提取物，干法裝柱，將浸膏狀提取物與硅膠按1 ∶1 比例拌樣，70%甲醇洗脫，減壓蒸餾回收甲醇，藥液濃縮至浸膏狀進(jìn)行冷凍干燥，得到凍干粉，編號(hào)與表1 一致。

2.2 HPLC 指紋圖譜建立

2.2.1 色譜條件 InertSustainC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1% 磷酸（B），梯度洗脫（0～30 min，5%～28% A；30～78 min，28%～80% A；78～88 min，80%A；88～100 min，20%～100%A）；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱(chēng)定“2.1”項(xiàng)下凍干粉（A10）0.2 g，置于50 mL 錐形瓶中，25 mL 甲醇超聲（100 Hz、30 Hz）提取5 min，溶解后冷卻靜置至室溫，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2 3 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取干燥至恒重的芹菜素對(duì)照品0.58 mg，置于25 mL 量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，搖勻，即得（0.023 2 mg／mL）。

2.2.4 圖譜生成 將對(duì)照品、供試品溶液按在2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012A 版）”，將供試品溶液中的色譜峰數(shù)據(jù)以中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜，得到11 個(gè)共有峰，見(jiàn)圖1～3。

圖1 11 批樣品HPLC 指紋圖譜

圖2 共有峰HPLC 色譜圖

圖3 芹菜素對(duì)照指紋圖譜

2.3 抗急性肝損傷研究

2.3.1 分組 140 只大鼠隨機(jī)分成14 組，每組10 只，分別為空白組（正常大鼠灌胃給予1 mL／100 g 蒸餾水，每天1 次，連續(xù)10 d）、模型組（造模大鼠灌胃給予1 mL／100 g蒸餾水，每天1 次，連續(xù)10 d）、陽(yáng)性藥組（造模大鼠灌胃給予3 mg／kg 聯(lián)苯雙酯滴丸混懸液［8-9］，每天1 次，連續(xù)10 d）、乙醇提取物組A1～A11（造模大鼠灌胃給予100 mg／kg乙醇提取物混懸液［10］，每天1 次，連續(xù)10 d）。

2.3.2 模型建立 各組大鼠連續(xù)灌胃給藥10 d，于第10天給藥后2 h 開(kāi)始造模，當(dāng)天大鼠禁食不禁水。除空白組外，其余各組大鼠均腹腔注射含10%四氯化碳的花生油液，劑量5 mL／kg［10］，建立急性肝損傷模型。

2.3.3 指標(biāo)檢測(cè) 大鼠末次灌胃給藥后禁食，24 h 后采集指標(biāo)，稱(chēng)定體質(zhì)量，腹腔注射10% 水合氯醛溶液麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，4 ℃下5 000 r／min 離心15 min，取血清，-80 ℃下冷凍保存。采用ELISA 法，檢測(cè)ALT、AST水平［11］。

2.3.4 結(jié)果分析 通過(guò)SPSS 21.0 軟件進(jìn)行處理，組間比較采用兩樣本均數(shù)t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見(jiàn)表2。由此可知，與空白組比較，模型組AST、ALT 水平升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組AST、ALT 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01）。

2.4 譜效關(guān)系研究

2.4.1 灰色關(guān)聯(lián)度分析 灰色關(guān)聯(lián)分析法是衡量因素間關(guān)聯(lián)程度的分析方法，亦稱(chēng)“灰色關(guān)聯(lián)度”，來(lái)自于20 世紀(jì)80 年代鄧聚龍教授提出并創(chuàng)立的一門(mén)新興學(xué)科——灰色系統(tǒng)理論［12］，近年來(lái)該方法在中藥譜效關(guān)系研究中的應(yīng)用較為廣泛。

表2 乙醇提取物對(duì)血清ALT、AST 水平的影響（，n＝10）

表2 乙醇提取物對(duì)血清ALT、AST 水平的影響（，n＝10）

注：與空白組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

本實(shí)驗(yàn)將指紋圖譜共有峰的相對(duì)峰面積作為子序列（表3），抗急性肝損傷的藥效指標(biāo)（AST、ALT）作為母序列（表4），采用均值法分別對(duì)參考序列、比較序列進(jìn)行無(wú)量綱化處理，計(jì)算灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)、關(guān)聯(lián)序，結(jié)果見(jiàn)表5。由此可知，各共有峰與AST、ALT 的相關(guān)系數(shù)均大于0.749，即與藥效具有較密切的相關(guān)性，其中5、1 號(hào)峰關(guān)聯(lián)度較高（＞0.9），表明乙醇提取物抗急性肝損傷的作用是通過(guò)其內(nèi)部“有效組分群”的協(xié)同作用所致，貢獻(xiàn)值依次為5 號(hào)峰（芹菜素）＞1 號(hào)峰＞9 號(hào)峰＞6 號(hào)峰＞7 號(hào)峰＞2號(hào)峰＞11 號(hào)峰＞4 號(hào)峰＞9 號(hào)峰＞8 號(hào)峰＞3 號(hào)峰。

表3 各共有峰相對(duì)峰面積

表4 11 批樣品血清ALT、AST 水平降低率

表5 各共有峰與AST、ALT 水平降低率的關(guān)聯(lián)度

2.4.2 多元線(xiàn)性回歸分析 選擇各共有峰相對(duì)峰面積的量化特征峰數(shù)據(jù)作為自變量（X），成分峰依次設(shè)為X1、 X2、……、 X11，給藥組AST、ALT 水平降低率分別作為Y1、Y2，采用SPSS 21.0 軟件，通過(guò)后退法建立多元線(xiàn)性回歸方程。結(jié)果，X1、 X8與抗AST 呈正相關(guān)，而X2與抗AST效應(yīng)呈負(fù)相關(guān)，譜效關(guān)系方程為Y1＝0.289+0.008X1-0.015X2+0.008X8（P ＜0.01，R2＝0.960）；X5、 X8與抗ALT 效應(yīng)呈正相關(guān)，譜效關(guān)系方程為Y2＝0.245+0.015X5-0.034X8（P＜0.01，R2＝0.929），表明方程中各自變量均有顯著相關(guān)性。

3 討論

灰色關(guān)聯(lián)度分析作為一種對(duì)模糊系統(tǒng)研究的有效手段，目前在各個(gè)行業(yè)領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用［13］，將其應(yīng)用于中藥材質(zhì)量差異評(píng)價(jià)也是一種趨勢(shì)，它能描述系統(tǒng)發(fā)展過(guò)程中各因素之間的相對(duì)變化，適用于解決中藥多成分、多類(lèi)別、多指標(biāo)的復(fù)雜體系的問(wèn)題，而多元線(xiàn)性回歸分析是研究1 個(gè)因變量（Y）與1 個(gè)或多個(gè)自變量（X）之間是否存在線(xiàn)性關(guān)系的方法［14］。由于相關(guān)分析方法中包括灰色關(guān)聯(lián)度分析，而多元線(xiàn)性回歸分析是其中1 個(gè)分支，是將變量相關(guān)關(guān)系轉(zhuǎn)變?yōu)楹瘮?shù)關(guān)系并建立表達(dá)式，用于研究變量間數(shù)量變動(dòng)關(guān)系的分析方法，故灰色關(guān)聯(lián)分析是多元線(xiàn)性回歸分析的基礎(chǔ)，兩者既相互區(qū)別，又相輔相成。因此，本實(shí)驗(yàn)采用灰色關(guān)聯(lián)分析和多元線(xiàn)性回歸分析研究拳卷地錢(qián)乙醇提取物HPLC 指紋圖譜與其對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)大鼠急性肝損的保護(hù)作用的譜效關(guān)系，以期探索指紋圖譜和藥效之間的相關(guān)性。

結(jié)果，各色譜峰與藥效的相關(guān)系數(shù)均大于0.7，指紋圖譜所建立的特征峰與拳卷地錢(qián)乙醇提取物抗急性肝損傷藥效均呈正相關(guān)，表明芹菜素及其他未確定結(jié)構(gòu)的化合物是其活性的基礎(chǔ)物質(zhì)，與其藥效有較大關(guān)聯(lián)。根據(jù)關(guān)聯(lián)度大小，確定11 個(gè)特征峰對(duì)抗急性肝損傷作用貢獻(xiàn)的依次序?yàn)? 號(hào)峰（芹菜素）＞1 號(hào)峰＞9 號(hào)峰＞6 號(hào)峰＞7 號(hào)峰＞2 號(hào)峰＞11 號(hào)峰＞4 號(hào)峰＞9 號(hào)峰＞8 號(hào)峰＞3 號(hào)峰，關(guān)聯(lián)度越大，活性越強(qiáng)。

多元線(xiàn)性回歸后退法是在灰色關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過(guò)SPSS 21.0 軟件將拳卷地錢(qián)乙醇提取物HPLC 指紋圖譜峰信息與抗急性肝損傷藥效相結(jié)合，建立譜效關(guān)系方程，以進(jìn)一步了解各共有峰與抗急性肝損傷藥效的關(guān)系，同時(shí)驗(yàn)證灰色關(guān)聯(lián)度分析的可行性與可靠性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)8 批樣品的共有峰和藥效數(shù)據(jù)建立拳卷地錢(qián)乙醇提取物抗急性肝損傷譜效關(guān)系方程，分別為抗AST，Y1＝0.289+0.008X1-0.015X2+0.008X8（P＜0.01，R2＝0.960），X1＞X2＞X8；抗ALT，Y2＝0.245+0.015X5-0.034X8（P ＜0.01，R2＝0.929），X5＞X8，與灰色關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果基本一致，而且該方程合理有效，可用于抗急性肝損傷藥效的預(yù)測(cè)，并對(duì)各共有特征峰所代表化學(xué)成分與抗急性肝損傷藥效的關(guān)系有更深入的了解，在一定程度上解決了成分與藥效斷層的問(wèn)題，對(duì)該藥材全面的質(zhì)量分析具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。