高效液相色譜指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量方法評(píng)價(jià)不同生長(zhǎng)年限肉桂藥材

張 永 ，丁 越，張 彤?，王 冰，王新宏，吳衛(wèi)剛

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203；2.中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所，上海 201203；3.九州通醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司，湖北武漢 430051）

肉桂別名牡桂、筒桂等，為我國(guó)中藥材中的一味重要南藥之一，素有一樹(shù)養(yǎng)三代的美譽(yù)，為廣東和廣西地區(qū)重要的中藥材。肉桂是我國(guó)的名貴中藥特產(chǎn)之一，自古藥食同源，其不僅是亞洲地區(qū)傳統(tǒng)的調(diào)味品，也是常用名貴中藥，功效以引火歸元，溫經(jīng)通脈見(jiàn)長(zhǎng)［1-3］。肉桂營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，具有較好的保健作用，特別是對(duì)糖尿病患者有一定調(diào)脂降糖的作用。廣東、廣西為我國(guó)肉桂藥材的道地產(chǎn)區(qū)，也是國(guó)內(nèi)的主產(chǎn)區(qū)，福建，云南亦產(chǎn)［4］。肉桂全身都是寶，2020 年藥典收錄其為樟科植物Cinnamomum cassia Presl 的干燥樹(shù)皮，其鮮嫩枝條以桂枝藥用，枝葉亦可提取揮發(fā)油，藥用或做食品添加劑。

長(zhǎng)期以來(lái)，肉桂以實(shí)生林粗放經(jīng)營(yíng)為主，種植后處于半野生狀態(tài)，作為藥材的肉桂，其有效成分含量易受種源品種、生長(zhǎng)環(huán)境、自然環(huán)境、采收季節(jié)及年限、加工方式和倉(cāng)儲(chǔ)運(yùn)輸條件等因素的影響。張錫純［5］認(rèn)為肉桂以完整、外皮細(xì)皺、“彩皮”（即灰白色地衣斑）明顯、“肉”（內(nèi)層皮）厚、含油量高、內(nèi)表面光潔如玉、斷面色深紫、香氣濃烈、甜味重、口嚼渣少者為佳。肉桂作為皮類中藥，根據(jù)其含有大量揮發(fā)油的特點(diǎn)，通常以厚度和油潤(rùn)度（揮發(fā)油）作為其優(yōu)劣的判斷方法。有文獻(xiàn)［6］報(bào)道肉桂的厚度及揮發(fā)油隨著樹(shù)齡的增大而升高。

目前對(duì)于肉桂藥材的質(zhì)量控制主要集中在桂皮醛和桂皮酸的含量測(cè)定上，并建立了一系列穩(wěn)定可靠的含量測(cè)定方法。查閱文獻(xiàn)可見(jiàn)，通常采用薄層掃描法［7］、導(dǎo)數(shù)光譜法［8］、氣相色譜法［9］、高效液相色譜法［10］建立肉桂醛和肉桂酸［11-12］的含量測(cè)定方法。中藥指紋圖譜是指運(yùn)用一定綜合性的分析方法，通過(guò)特征性色譜圖或光譜圖，在整體上對(duì)其化學(xué)特征進(jìn)行表征，是目前被公認(rèn)為最有效的綜合性評(píng)價(jià)中藥的整體質(zhì)量的技術(shù)手段之一［13-14］。為考察肉桂生長(zhǎng)年限與其主要有效成分含量的關(guān)系，本研究分別于2017年4 月和2017 年10 月收集了同一地區(qū)不同生長(zhǎng)年限的肉桂藥材，包括2～5、5～7、7～10、11～15、20～30 年及30 年以上肉桂樣品，采用高效液相色譜法進(jìn)行其指紋圖譜研究，并采用主成分和聚類分析法［14-15］探究不同生長(zhǎng)年限的指紋圖譜差異性，為肉桂藥材資源的可持續(xù)發(fā)展提供依據(jù)。

1 材料

Agilent 1290 Series 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；TDL-50B 離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；JP-100S超聲波清洗機(jī)（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）；BSA124分析天平（美國(guó)賽多利斯公司）。

桂皮醛對(duì)照品（批號(hào)110710-201619，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；香豆素（批號(hào)Y2407C2349）、2-甲氧基肉桂酸（批號(hào)T15F8T29343）、2-羥基肉桂醛（批號(hào)B02401101）、肉桂醇（批號(hào) Y04N7C23850 ）、肉桂酸（批號(hào)AA0807DA14）對(duì)照品，均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；2-甲氧基肉桂醛對(duì)照品（批號(hào)B02401101，西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）；乙腈（色譜純，德國(guó)Merck 公司）；甲醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；屈臣氏蒸餾水。肉桂樣品S1～S3、S4～S6、S7～S9、S10～S12、S13～S15、S16～S18 分別購(gòu)自廣東省高要縣董福行基地種植2～5、5～7、7～10、11～15、20～30 年及30 年以上，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院宋龍博士鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取香豆素、2-羥基肉桂醛、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、2-甲氧基肉桂酸、2-甲氧基肉桂醛適量，50%甲醇溶解并定容10 mL，搖勻，即得分別為0.1696、0.1018、0.1616、0.2056、0.2660、0.1086、0.2 196 g ／L 的對(duì)照品貯備液。

2.2 供試品溶液制備 取肉桂藥材粉碎（過(guò)3 號(hào)篩），精密稱取粉末0.5 g，置50 mL 圓底離心管中，加入50%甲醇10 mL，超聲（350 W，35 kHz）處理30 min，放冷，離心，取上清至25 mL 量瓶中。加入上述甲醇溶液10 mL，同法超聲處理1 次，放冷，離心，取上清至同一25 mL 量瓶中。經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件和系統(tǒng)適應(yīng)性 Agilent SB-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；柱溫40 ℃；體積流量0.4 mL／min；進(jìn)樣量2 μL；流動(dòng)相0.025%甲酸水溶液（A）-乙腈溶液（B），梯度洗脫（0～2 min，8% B；2～20 min，8%～35% B），各對(duì)照品與其他成分的色譜峰分離度符合要求，峰形對(duì)稱。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.4 指紋圖譜建立

圖1 肉桂HPLC 色譜圖

2.4.1 共有峰確定 將不同批肉桂藥材的UPLC 色譜圖，分別導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2.0 版），生成對(duì)照指紋圖譜R，結(jié)果見(jiàn)圖2。在對(duì)照指紋圖譜上，標(biāo)定了9 個(gè)特征峰（占總峰面積95% 以上），能夠較全面的反映肉桂藥材不同生長(zhǎng)時(shí)期的特征，因此暫定為不同生長(zhǎng)年限肉桂藥材的活性成分群。通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，在各樣品圖譜中6 個(gè)特征峰被指認(rèn)，香豆素（4 號(hào)），2-羥基肉桂醛（5 號(hào)），肉桂醇（6 號(hào)），肉桂酸（7 號(hào)），桂皮醛（8號(hào)），2-甲氧基肉桂醛（9 號(hào)）。其中，2-甲氧基肉桂醛是除桂皮醛含量最高的成分，分離度良好，具有適宜保留時(shí)間，故選為參照峰。

圖2 不同生長(zhǎng)年限肉桂的指紋圖譜

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取同一供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄HPLC 色譜圖。以9號(hào)峰作為參照峰，各特征峰相對(duì)峰面積RSD＜3.9%，相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.4%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批肉桂粉末，平行處理6 份，在“2.3”項(xiàng)條件下，分別進(jìn)樣，記錄HPLC 色譜圖。以9號(hào)峰為參照峰，各特征峰相對(duì)峰面積RSD＜4.1%，相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)條件下，分別于0、2、4、8、12、18、24、48 h 進(jìn)樣，記錄指紋圖譜。以9 號(hào)峰為參照峰，各特征峰相對(duì)峰面積RSD＜4.1%，相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.2%，表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 相似度評(píng)價(jià) 在未剔除桂皮醛色譜峰前提下，S1～S18 指紋圖譜相似度均大于0.98，桂皮醛過(guò)高的峰面積使得不同年限肉桂藥材的相似度沒(méi)有明顯差別。孫如煜等［15］通過(guò)指紋圖譜研究清開(kāi)靈硬膠囊批次間穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)時(shí)，黃芩苷由于峰面積過(guò)大導(dǎo)致相似度評(píng)價(jià)方法對(duì)色譜峰的大小變化或缺失不夠靈敏，不利于對(duì)指紋圖譜的綜合性評(píng)價(jià)，故采用剔除對(duì)指紋圖譜貢獻(xiàn)率較大的成分-黃芩苷。而考慮到桂皮醛占總面積的百分比較大，其在指紋圖譜權(quán)重系數(shù)較大，占主導(dǎo)作用，無(wú)法準(zhǔn)確比較不同生長(zhǎng)年限肉桂藥材的差異，故需剔除桂皮醛，重新計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表1。S1～S15 與對(duì)照譜的相似度均大于0.75 且相似度較為接近，為Ⅰ類；S16～S18 與對(duì)照譜的相似度均小于0.6 且相似度比較接近，為Ⅱ類，表明在剔除桂皮醛色譜峰后，30 年以上與30 年以下的肉桂在主要成分存在著明顯差異，此可作為名老中醫(yī)喜用年份久肉桂的一個(gè)佐證。通過(guò)對(duì)共有峰分析，發(fā)現(xiàn)Ⅱ類中峰1、峰2 和峰3 比Ⅰ類中的相應(yīng)色譜峰小，而Ⅱ類中峰4、峰5 和峰7 比Ⅰ中的相應(yīng)色譜峰大，這可能是造成其相似度差異的重要原因之一。

表1 18 批樣品相似度分析結(jié)果

2.7 主成分分析與聚類分析 主成分分析是以相互聯(lián)系的原始數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，尋找?guī)讉€(gè)能夠?qū)υ兄笜?biāo)性成分保留其主要信息且相互不關(guān)聯(lián)的綜合性變量，對(duì)其進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)的一種方法［16］。將上述18 批樣品9 個(gè)特有峰的峰面積導(dǎo)入統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0 進(jìn)行主成分分析，提取了3 個(gè)主成分。其中，第一和第二主成分特征值分別為4.8 和2.8，累計(jì)貢獻(xiàn)率為69.6%，說(shuō)明不同年生長(zhǎng)限肉桂藥材可用這2 個(gè)新生成的變量代替原有的9 個(gè)特征峰進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)價(jià)。以第一、二主成分的得分為縱橫坐標(biāo)，繪制得分圖，見(jiàn)圖3。代表著肉桂酸，香豆素和2-甲氧基肉桂醛的變量權(quán)重值在第一主成分中最大，說(shuō)明這3 個(gè)色譜峰在區(qū)分不同年限的肉桂有一定的決定性作用，分別以肉桂酸，香豆素和2-甲氧基肉桂醛色譜峰峰面積為變量，繪制三維圖，見(jiàn)圖4。從圖3、5 可以清晰看到不同年限的肉桂被很好劃分為2 大類，Ⅰ類包括S1～S15。為30 年以下肉桂藥材；Ⅱ類包括S16～S18，為30 年以上肉桂藥材。主成分得分圖很好將不同生長(zhǎng)年限的肉桂藥材樣品分為30 年以上和30 年以下兩大類，其結(jié)果相似度評(píng)價(jià)相一致。

聚類分析是一種不將研究對(duì)象信息及貢獻(xiàn)性刪減，以一定分析手段將關(guān)系相近的研究對(duì)象進(jìn)行合理的分類的綜合性手段之一［17］。本研究采用夾角余弦和組間平均數(shù)連接法對(duì)18 批樣品的9 特征峰進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。可知，不同生長(zhǎng)年限肉桂藥材樣品可化分為2 大類。Ⅰ類包括S1～S15；Ⅱ類包括S16～S18。系統(tǒng)聚類分析結(jié)果與其他分析結(jié)果一致，為評(píng)價(jià)不同生長(zhǎng)年限藥材提供一種新的思路。

圖3 18 批樣品主成分分析圖

圖4 18 批樣品主成分分析三維圖

圖5 18 批樣品聚類分析圖

3 討論

3.1 指紋圖譜 肉桂作為一種中藥材，從種植、采收、加工、運(yùn)輸、貯存到出售總共經(jīng)歷數(shù)個(gè)過(guò)程，其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)的偏差都可能影響到質(zhì)量，最終影響到臨床療效。再者，中藥材作為多組分復(fù)雜體系，其成分一般較為復(fù)雜，單靠一種或幾種指標(biāo)成分來(lái)判定其質(zhì)量缺乏一定的說(shuō)服力。中藥指紋圖譜是一種可量化的綜合性方法，能在整體上對(duì)中藥指標(biāo)性成分進(jìn)行特征性的反映。本研究建立UPLC 指紋圖譜中，9 個(gè)特征峰被標(biāo)定，其中的6 種成分被識(shí)別為香豆素、2-羥基肉桂醛、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛和2-甲氧基肉桂醛。這9 個(gè)特征峰在不同生長(zhǎng)年限肉桂的指紋圖譜中均有發(fā)現(xiàn)，但各樣品中這些特征峰的相對(duì)峰面積差異性較大，結(jié)合相似度分析的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)不同生長(zhǎng)年限的肉桂在化學(xué)組成上存在共性，但也存在一定差異性，此差異性在圖譜中主要表現(xiàn)為共有峰的相對(duì)峰面積不同。指紋圖譜能夠在整體上對(duì)不同年限肉桂進(jìn)行綜合性評(píng)價(jià)，是質(zhì)量控制方法的重要組成部分。

3.2 聚類分析與主成分分析 由于不同生長(zhǎng)年限指紋圖譜的共有峰的數(shù)據(jù)繁瑣，且其權(quán)重系數(shù)無(wú)法加以確定，對(duì)肉桂藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)帶來(lái)了極大的困難。故本研究采用主成分分析法，在保證原有信息不缺失前提下，將指紋圖譜的9個(gè)指標(biāo)成分轉(zhuǎn)換成能充分反映肉桂樣品總體信息的指標(biāo)的2 個(gè)主成分，且提取出了在不同年限肉桂的指紋圖譜中起決定性作用3 種有效成分根據(jù)聚類分析的結(jié)果，將18 批不同生長(zhǎng)年限的肉桂劃分為2 類，使得不同年限肉桂藥材的質(zhì)量得到了良好的劃分。聚類分析、主成分分析與相似度評(píng)價(jià)有機(jī)結(jié)合起來(lái)，以期為確定肉桂的最佳采收年限及資源可持續(xù)發(fā)展提供了科學(xué)依據(jù)。

同時(shí)，研究結(jié)果表明幾種分析方法雖然從不同的側(cè)重角度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，但都能得出類似的結(jié)論，說(shuō)明這種綜合分析的方法具有一定的可行性。肉桂藥材為揮發(fā)油成分含量較高的一類中藥材，市場(chǎng)上通常選取了最宜量化外觀性狀厚度作為其主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，在本研究中也發(fā)現(xiàn)不同生長(zhǎng)肉桂藥材隨著年限增加，厚度也逐漸變厚，而其指標(biāo)性成分并非是某種成分含量普遍高于另一種，如何通過(guò)建立外觀性狀與內(nèi)在指標(biāo)成分關(guān)聯(lián)性評(píng)價(jià)其質(zhì)量?jī)?yōu)劣，是今后需要探討的重點(diǎn)。