不同采收期大接骨丹HPLC 指紋圖譜建立及化學模式識別

韓忠耀 ，張 濤 ，李 燕，胡志平，陸廷祥，王傳明，王玉明，王應肅

（1.黔南民族醫學高等專科學校，貴州都勻 558000；2.天津中醫藥大學，天津 300193）

大接骨丹來源于山茱萸科植物有齒鞘柄木Toricellia Angulata Oliv.var. intermedia（Harms）Hu 的根皮，別名水冬瓜根皮、水五加等［1］。當前，針對大接骨丹的研究，主要集中在有效成分的分離與鑒定［2-5］、抗炎鎮痛藥效［6］、免疫抑制活性［7-8］、病蟲害種類及野生資源破壞情況調查［9］、提取工藝優化［10］以及質量控制［11-14］等，尚未見對黔產不同采收期大接骨丹HPLC 指紋圖譜的研究。本實驗首次針對黔產不同采收期大接骨丹建立HPLC 指紋圖譜，并結合相似度評價、聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）等化學計量學統計分析軟件，對不同采收期大接骨丹進行質量評價，以期為從整體上控制其質量提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀（DAD 檢測器，美國Agilent 公司）；FA1004B 型電子天平（溫州瑞昕儀器有限公司）；101-3AB 型烘箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；HH-S8 雙列八孔水浴鍋（常州邁科諾儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 紫丁香苷對照品（北京盛世康普化工技術研究院，批號161214）；乙腈（色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司，批號20160504）；磷酸［分析純，重慶川東化工（集團）有限公司，批號20140201］；水為娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司，批號20180407）；其他試劑均為分析純。大接骨丹藥材自采于貴州省都勻市杉木湖溝渠（生長環境為露天向陽山坡、溝渠，周圍榜流動溪水，黃壤土，伴生植物主要有芭茅、囊吾、腎蕨、及己、三葉鬼針草等），經黔南民族醫學高等專科學校藥學系王傳明副教授鑒定為山茱萸科植物有齒鞘柄木Toricellia Angulata Oliv.var.intermedia（Harms）Hu 的根皮，信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agela Promosil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.5% 磷酸水（B），梯度洗脫（0～10 min，9% A；10～20 min，9%～14.4% A；20～25 min，14.4%～18%A；25～45 min，18%～21.5%A；45～60 min，21.5%～70% A；60～60.1 min，70%～9% A；60.1～70 min，9%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫35 ℃；檢測波長230 nm；進樣量5 μL，保留時間為70 min。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 取紫丁香苷對照品，精密稱定，置于量瓶中甲醇溶解，搖勻，得0.172 0 mg／mL 的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 自采的鮮藥材50 ℃下烘干，粉碎后過4 號篩，裝入自封袋，貼標簽后備用。分別稱取各采收期內藥材粉末，每份約0.5 g，精密稱定，置250 mL 圓底燒瓶中，精密加入用甲醇50 mL，回流提取1 h 后，放冷，濾過，用甲醇補足每份濾液為50 mL，搖勻。各濾液分別經0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取同一批（G6）供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下，連續進樣6 次，測得各共有峰相對保留時間RSD 均小于2.15%，各共有峰相對峰面積RSD 均小于1.09%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取同一批（G6）供試品6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，測得各共有峰相對保留時間RSD 均小于1.31%，各共有峰相對峰面積RSD 均小于2.63%，表明該方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗 取同一批（G6）供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下，分別于0、4、8、12、24、36、48 h進樣，測得各共有峰相對保留時間RSD 均小于0.97%，各共有峰相對峰面積RSD 均小于2.44%，表明供試品溶液在48 h 內穩定性良好。

2.4 指紋圖譜建立 取11 批樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，將AIA 格式圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.130723 版本），以G6 為參照圖譜，以“中位數”生成對照圖譜，時間寬度為0.1，得到11 批樣品HPLC 指紋圖譜，見圖1～2。以共有峰2（S）紫丁香苷為參照峰S，計算14 個共有峰的相對保留時間和相對峰面積，見表2～3。14 個共有峰的相對保留時間的RSD 均＜3.00%，而共有峰的相對峰面積的RSD 值波動較大，除參照峰2（S）外，在37.22%～134.07%，表明不同采收期內大接骨丹二次代謝產物積累呈顯著性差異。

圖1 不同采收期大接骨丹對照品圖譜

圖2 11 批不同采收期樣品HPLC 指紋圖譜

表2 11 批不同采收期樣品共有峰相對保留時間

表3 11 批不同采收期樣品共有峰相對峰面積

2.5 化學模式識別

2.5.1 相似度評價 利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.130723 版本），全峰匹配模式，以中位數生成對照指紋圖譜后，利用該軟件計算其相似度，結果表明，不同采收期大接骨丹與對照圖譜相似度在0.911～0.997，見表4。

表4 11 批不同采收期樣品相似度

2.5.2 聚類分析 以14 個共有峰相對峰面積導入SPSS 18.0 統計學軟件，采用組間均聯法，以歐式平方距離為分類依據，進行系統聚類，不同采收期大接骨丹聚類分析結果見圖3。結果表明，當分類距離為25 時，聚類分析將11批不同采收期大接骨丹藥材分為2 類，其中G8 單獨聚為第一類，其他批聚為第二類。當分類距離＜3 時，G1～G11 分別對應樣本采集月份，發現G4、G5、G6、G7 為一小類，G1、G3 為一小類，G9、G10、G11、G2 為一小類，G8 單獨為一類，從聚類分析可以看出，雖然不同采收期內相對峰面積RSD 差異性較大，但是不同采收期大接骨丹質量相對穩定、可控，這與相似度結果基本一致。

圖3 11 批不同采收期樣品聚類分析樹狀圖

2.5.3 主成分分析和正交偏最小二乘法-判別分析 參考文獻［15-16］，將14 個共有峰相對峰面積作為變量，導入SIMCA-P+12.0 在軟件自動擬合求解后，進行主成分分析和OPLS-DA 分析，結果見圖4～5。主成分分析結果顯示，G8 樣品主成分分析得分較高且G8 偏離圖4 中心點最遠，與其他批呈顯著性差異，該結果與聚類分析結果基本保持一致。OPLS-DA 分散點圖驗證了主成分分析與聚類分析結果，1 組與2 組區分結果較好。同時，14 個共有峰相對峰面積的VIP 值順序依次為峰3、13、4、7、11、9、12、8、7、6、14，結果顯示峰3、13、4、7、11、9、12、8 共8 個共有峰的VIP 值大于1，峰5、10、1、7、6 共有峰VIP 值均大于0.7，峰14 VIP 值均大于0.4。VIP 結果表明峰3、13、4、7、11、9、12、8 對不同采收期樣品的分類具有顯著性影響，為其主要化學成分質量標志物，可用于其質量控制的關鍵性二次代謝產物指標性化學成分。

3 討論

圖4 11 批不同采收期樣品主成分分析得分散點圖

圖5 11 批不同采收期樣品OPLS-DA 得分散點圖

本實驗在預實驗時，考察了不同提取溶劑、提取方法、色譜柱、流動相等條件，發現流動相0.5%-磷酸水顯著優于0.5%-醋酸水。不同采收期大接骨丹在230 nm 時，樣品吸收峰較多，且分離度較佳，最終確定了“2.1”項下條件。

采集樣品時，根據采集年份不同采收期大接骨丹地上部分生長趨勢，采取單月的月中采集1 次或單月的10 日、20 日采集2 次。相似度評價時，與4 至12 月份樣本相比，發現1 至3 月份相似度較低，可能與當年當地氣候或過冬氣候節令有關。采集樣品當年，大接骨丹較往年3 月份地上部分開始萌芽推遲近1 個月，4 月初地上部分開始萌發新芽。結合生產與用藥實際，建立了適應譜相對較寬的4至12 月樣品HPLC 指紋圖譜，有利于藥材的質量控制。氣候等外部環境對大接骨丹二次代謝產物積累規律，有待進一步深入研究。

本研究利用HPLC 技術與指紋圖譜質量控制技術，建立不同采收期內黔產大接骨丹HPLC 指紋圖譜，同時，利用相似度評價、聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘法-判別分析等化學計量學技術，對黔產不同采收期大接骨丹的質量進行客觀性評價，以期為該藥的質量控制、資源開發、少數民族聚集地民間用藥及民族醫療機構或中醫院臨床用藥提供參考。