可吸收止血材料降解代謝評價策略和放射性標記聯合HPLC-MS 技術應用

張天宏，李敬來，張振清

1.國科卓越（北京）醫藥科技研究有限公司，北京 100176；2.北京蘇雅醫藥科技有限責任公司，北京 102629

及時有效的止血是創傷后傷者或手術中患者預后甚至存活的關鍵因素［1-2］。作為止血手段之一，針對不同的應用場景（體表出血或內臟出血，輕微滲血，少量積血，中度流血）［3］，各種類型的可吸收止血材料已經在全球廣泛使用。表1 總結了多種分類依據［4-5］，其中分子類型和制備工藝，直接關系到產品的理化性質、體內降解規律、療效、毒性反應。

表1 已上市可吸收止血材料的分類

可吸收止血材料臨床使用中潛在的不良反應主要分兩類：（1）過敏反應，局部化學異物或感染引起的或炎癥反應和肉芽腫，這與止血材料的降解速率和物理機械作用引發有關；（2）使用后，止血材料降解吸收過程中產生的毒性物質的機體暴露。其中1 類不良反應較為常見［6］，需要規范使用操作來解決；2 類不良反應尚未見報道，但隨著新型止血材料的研發，不能排除這種風險。為排除2 類風險，新產品研發過程中，以體內的處置動力學研究為基礎的，科學嚴格的安全性評價工作非常重要。

外源物的體內動力學是藥理毒理學的基礎。詳盡闡明外源物在體內的處置過程是解釋藥效和毒性的物質基礎，也是確保應用于人體后，病人免于危險物質或危險水平暴露的關鍵。作為外源物質（包括食物、藥物、毒物、化妝品等）的一種，可吸收止血材料的體內代謝（metabolism）和處置（disposal）的動力學研究也遵循共同的研究策略。目前藥物代謝動力學研究比較充分，具備嚴謹的理論基礎、豐富的文獻資料，因此本文重點借助藥物代謝動力學的理論和成果，結合可吸收止血材料自身的特點，討論該類產品體內動力學研究的方法和策略。

與藥代動力學相比，可吸收止血材料的體內代謝和處置的動力學具有自己獨特的特點。不同于經典的給藥途徑，可吸收止血材料直接應用于組織表面（創面），凝固并被包裹。典型的藥物體內動力學過程包括了吸收、分別、代謝、排泄（absorption，distribution，metabolism，excretion，ADME），除個別情況外，例如某些苷類中藥在口服后于胃腸道分解為苷原的過程，藥物在給藥部位的代謝過程幾乎可以忽略。相比之下，止血材料在吸收前會在體液的作用下發生降解代謝，主要以降解產物的形式吸收。且這種吸收前的降解代謝往往受到反應接觸面積的限制，反應速率遠慢于胃腸道中，并可能是這類物質使用后體內動力學過程的限速步驟。這種特殊的體內動力學表現，也是本文開頭所提出的這類產品的所表現出的多數1 類毒副作用的原因。

除了上述的給藥部位先代謝后吸收的特點，可吸收止血材料的另一個體內動力學的獨特特點是，吸收入血的降解產物為不同分子量的一組低聚物，且多為內源性成分。由于降解吸收限速的原因，這些內源性降解產物組的非給藥部位暴露很低，持續時間長。這些特點給該類材料的體內動力學研究帶來極大的挑戰，目前主流的解決方案是放射性標記示蹤技術結合液相色譜—質譜聯用技術（HPLC-MS）分析手段。本研究總結了該方法的原理、優劣勢、試驗流程和相關重要的影響因素，以期為該類產品體內動力學研究方案設計提供支持和選項。

另外，不同類型的可吸收止血材料的研發過程中經常面臨體內動力學研究策略的問題。例如，有些產品的理論代謝產物是內源性物質；有些是天然物質進行了部分修飾；有些則完全是非天然成分。這些產品在體外研究的基礎上，是否有必要進行體內動力學研究，是否需要采用放射性標記，研究到什么程度，才能滿足注冊申報的證據標準。關于這些問題，我們提出的解決方案是，在充分理論和體外實驗評估的基礎上，將可吸收止血材料按降解產物風險等級分為低、中、高三個水平，根據不同的風險等級采用相應的體內代謝動力學研究策略和放射性標記示蹤技術結合HPLC-MS 分析方案。

最后，按照三級風險分類，分別總結了可吸收止血材料在體外降解規律和體內代謝動力學的進展，為此類產品的降解代謝評價策略和放射性標記聯合HPLC-MS 技術應用提供理論和實踐的支持。

1 放射性標記示蹤技術結合HPLC-MS 分析

1.1 放射性標記示蹤與HPLC-MS 的互補性

外源物的體內動力學研究關注的是物質的定位（location）、定量（quantitation）、定性（qualification），因此這門學科的發展強烈依賴于檢測手段的進步。近20 年來，隨著檢測手段的更新進步，尤其是HPLC-MS 聯用技術的成熟（在專屬性、定性鑒別和定量檢測靈敏度的優勢），極大促進了外源物的體內動力學的學科發展。但由于化合物電離的影響因素復雜，導致HPLC-MS 定量依賴于標準品，并無法區分所測定物質的外源性或內源性。一旦受試物質體內代謝廣泛，面對眾多不同的代謝物，該技術將無法實現對外源物代謝特征的全面考察，包括總體代謝途徑和各途徑對總消除的相對貢獻。

與之互補的是放射性同位素標記示蹤技術，已經用于外源物體內動力學研究60 年了，目前仍是一種全面的同時也是高靈敏度的體內代謝處置動力學研究方法。雖然現有的分析技術突飛猛進，但僅有放射性示蹤技術能夠直接、明了地揭示每一種代謝物占總外源物相關物質暴露的百分比，因此該方法是創新藥物代謝研究不可或缺的手段。長期以來，放射性同位素標記示蹤法被公認為獲得全面代謝相關信息的最有效手段（金標準）（沒有之一）。美國FDA 審評的新藥中85%以上在藥物代謝和安全性評價中使用了放射性標記示蹤技術。

放射性同位素示蹤法的優點［7］：（1）可去除干擾，區分內源性和外源性物質，發揮示蹤作用。（2）標記物與非標記物的化學結構完全一致，物理、化學性質及生物活性非常相近。（3）生物細胞不能區分同一元素的各種同位素，而是一視同仁地對待。（4）靈敏度高，例如，可吸收止血材料降解吸收緩慢，導致體內非給藥部位暴露極低，要求檢測方法必須具有極高的靈敏度。（5）定量方法無需標準品，簡便直接，對于某個特定的放射性原子，其放射性（在單位時間內發生衰變的概率、輻射形式）與鄰近原子的情況無關，也與原子的化學狀態及物理條件無關（因為它們只影響外層電子）。（6）適用于代謝途徑復雜廣泛或代謝產物標準品不易獲得的外源物體內動力學研究。

放射性同位素示蹤法的缺點：（1）產生放射性污染；（2）考慮到輻射安全的因素，需具備研究資質；（3）無法進行物質定性，即無法鑒定標記分子的形式。可見，放射性同位素示蹤法與HPLC-MS 法具有高度的互補性。二者聯合研究是目前主流的方法，具體研究策略見圖1。

圖1 放射性同位素示蹤技術聯合HPLC-MS研究策略

1.2 放射性標記示蹤技術流程

1.2.1 放射性標記物的制備 目前常用于外源物體內動力學研究的放射性核素有14C、3H、32P、33P、35S、125I 和131I 等。核素的選擇和標記合成試驗設計原則：（1）14C 優于3H，14C 標記在分子骨架中，3H 位于分子骨架的側枝，體內存在1H-3H 交換的風險，從而影響示蹤結果。（2）分子內標優于分子外標，分子內標（如3H 或14C）的標記物與非標記物的化學結構完全一致，物質在生物機體內的化學變化和生物學過程相同，但對于大于10 KDa 的大分子采用125I 的分子外贅合標記，也是可以接受的。同時，實驗中需要對脫標記進行監測，一旦脫標記占比過高，將影響數據質量。（3）定位標記優于非定位標記，定位標記的實驗結果明確。以1H-3H 交換法為基礎的非定位標記，不可控因素較多，實驗中應關注脫標記質控。（4）在可商業化購買的放射性標記原料和合成實驗可行性的前提下，選擇盡量短的合成路線，縮短試驗周期，提高產率。（5）3H 定位標記位點選擇時，應注意避開氧化代謝軟點；14C 標記位點應選擇分解代謝后分子所關注的部分，否則損失體內示蹤的代表性。（6）對于預期分解代謝為不同分子結構的產品，可選擇不同核素雙標記，節省實驗資源。

1.2.2 放射性標記物的表征 放射性標記物的表征包括：（1）物理化學特性表征，應與非標產品一致。（2）通過高效液相色譜（HPLC），質譜（MS），核磁共振（NMR）等手段表征，應與非標產品一致。（3）HPLC 放射性色譜等手段鑒定放化純度。（4）通過總放射性活度檢測，計算比活度，應滿足實驗動物需求。（5）測定標記樣品的穩定性。

1.2.3 放射性標記物臨床前試驗 本部分實驗目的是：運用經驗證的定量、定性測定方法，在可靠的物質平衡數據（回收率＞85%）支持下，充分展示給藥后受試物相關物質體內暴露情況，原形物和代謝產物總體和分別的動力學過程［8］。具體包括：（1）確定血液、組織、排泄物中總體（總放射性）動力學規律；（2）確定血液和排泄物中的代謝產物全譜；（3）給藥位點總體消除過程；（4）確定人和動物體外代謝產物譜、顯示種屬差異、以便正確選擇毒理研究動物種屬；（5）通過放射性代謝產物鑒定人體代謝酶，早期發現人體高比例代謝產物，并為藥物相互作用研究的試驗設計提供依據。對于可吸收止血材料，基本不涉及后2 點。

實驗過程包括以下步驟（以3H 和14C 為例）。

藥物配置：將非標的受試物與標記受試物按一定比例混合，配制與臨床應用一致的劑型。考慮到可吸收止血材料的代謝特點（吸收慢，體內暴露低，研究周期長），可提高放射劑量，以滿足檢測需求。

動物給藥：盡可能模擬臨床給藥方式。

樣品采集：樣品包括血、組織、排泄物。對于藥物體內物質平衡研究，采集周期應滿足排泄物中回收到總給藥放射性的85%（3H）或90%（14C）以上，或日排泄放射性占總給藥量的1%以下。但對于可吸收止血材料，由于體內過程較慢，需依據自身特點或預實驗結果，參考藥物研究的標準，設置合理的采樣周期。組織分布研究中除血、肝、腎、腦等重要器官外，另應重點關注給藥部位，采樣時盡可能擴大范圍，以免損失放射性，造成給藥部位藥量的低估。尿糞回收采樣周期結束后，動物應進行全面的組織采樣測定，這對于解釋物質平衡的數據非常關鍵。

樣品處理：液體樣品（血漿，尿液）可直接或稀釋后與閃爍液混合；固體樣品（糞便，組織）需經勻漿均質化后取樣，氧化燃燒后回收到閃爍液中；全血干斑也需經氧化燃燒后測定。實驗中注意平行插入質控樣品，以隨時監測氧化燃燒效率的穩定性和均一性。

基于液體閃爍計數（liquid scintillation counting）總放射性活度測定：各種待測樣品的基質不同，可能影響到閃爍計數效率和猝滅，需要分別進行標定和質控驗證。

液相放射性色譜檢測技術（liquid radiochromatography）：結合分離HPLC 和MS 手段代謝物譜，如圖1 所示，可采用在線或離線放射性檢測。

放射性自顯影技術（radioautography）：尸體冷凍，整體切片，放射自顯影［9］。本質上等同于組織分布實驗，優勢是更直觀。

2 可吸收止血材料體內動力學研究策略

全球，包括FDA，沒有針對可吸收醫療器械體內處置動力學研究技術指導原則。本研究參考藥代動力學研究的相關原則，針對可吸收醫療器械體所獨有的給藥方式和可能的體內處置規律特點，嘗試提出一個初步解決方案，拋磚引玉。

本研究的最終目的是充分闡明止血材料體內降解后ADME 過程，包括受試物在給藥部位消除的動力學過程，體內主要降解產物體內暴露曲線，相關代謝終產物排泄動力學過程等。簡單說，就是降解機制，降解特性，降解產物譜和相關產物的動力學過程。一般這些研究均在非臨床階段完成，主要包括體外降解試驗和體內研究。因此，試驗設計應以簡單、非標方法優先為原則，綜合考慮受試化合物的分子結構信息和體外實驗的代謝物結果，確定項目的總體研究策略和放射性標記示蹤技術結合HPLC-MS 分析方案。具體見圖2。

圖2 可吸收止血材料體內處置動力學研究策略

從化學分子結構角度，止血材料為經化學修飾改性或化學反應聚合而成的含有重復單元的高分子材料。首先應分析判斷止血材料的化學分子結構中是否含有非天然的潛在安全性擔憂的化學基團。據此可將止血材料按降解產物風險等級分為低、中、高三個水平，分別對應表1 中按制備工藝分類的三個類別。

體內分析中會遭遇諸如基質復雜，代謝產物與內源性物質一致等困難，另外按臨床植入方式給藥后，受試物完全降解消除可能耗時較長，更加降低代謝產物的體內暴露濃度，以上因素給定性和定量分析帶來挑戰。因此，首先需要進行體外降解試驗（試驗1），并與體內研究（試驗2）相互配合。

在試驗1 中，可利用生物相關的酶或其他加速降解手段，對受試物的降解能力（穩定性）進行初步判斷，并鑒定溶出液體中可能的代謝物譜，判定降解途徑和是否產生非內源性代謝產物。

如果在試驗1 中沒有非內源性物質的生成，且受試物分子結構中沒有非天然的潛在安全性擔憂的化學基團，例如低風險類，或中風險類中符合以上判斷標準的產品，可進行非標記體內研究（試驗2-1），按臨床植入方式給藥后，觀察受試物在給藥部位消除的動力學過程。由于產物均為內源性物質，可不必考察主要降解產物體內暴露曲線和排泄動力學過程。

如果在試驗1 中發現非內源性物質的生成，或止血材料的化學分子結構中含有非天然的潛在安全性擔憂的化學基團，二者滿足其一，即啟動放射性標記試驗（試驗2-2），按3 項下進行全面的體內動力學考察。例如高風險類，或中風險類中符合以上判斷標準的產品。

總結以上的研究策略（具體決策樹見圖2），可見低風險類可進行非標記研究；高風險類必須進行放射性標記的體內處置研究；中風險類的研究策略選擇需結合體外試驗代謝物譜結果，和分子結構分析，綜合判斷。

另外，不能排除其他有效的可接受的標記示蹤手段，例如熒光標記等，以及未來創新的研究方法，在可吸收止血材料體內ADME 研究中的貢獻。

3 可吸收止血材料體內動力學研究進展

總結現有的公開發表的文獻資料，可以發現，可吸收止血材料體內動力學研究策略和放射性標記示蹤技術結合HPLC-MS 分析方案基本遵循了上述決策樹的原則，具體如下。

低風險產品由于沒有生成非內源性物質的潛在安全性擔憂，僅進行非標記代謝研究，即按臨床植入方式給藥后，僅觀察受試物在給藥部位消除的動力學過程。例如淀粉類，主要降解為寡糖或單糖，通過碘-淀粉顯色反應等手段，觀察到受試物在植入部位7 d 即完全清除［10-11］；殼聚糖類，在體內經巨噬細胞的幾丁質酶和溶菌酶作用下生成殼寡糖，再進一步生成 β-葡萄糖胺，通過病理切片和染色，顯微鏡下觀察手段，發現受試物在植入部位3～6 周即完全清除［12-15］；明膠及膠原可通過酶解（主要是明膠酶和組織蛋白酶）的方式降解為氨基酸，植入體內后降解時間分別為4～6 周及8～12 周［16-19］。

高風險產品由于具有生成非內源性物質的潛在安全性擔憂，需通過放射性標記方法，進行全面的體內動力學考察。例如，氰基丙烯酸酯類粘合劑或聚乙二醇類密封膠，主要通過水解（合成的逆過程）的方式降解［20-21］，體內的降解周期至少為3～8 周［22］。

中風險產品來源于天然物質經化學修飾或改性而獲得的，可根據圖2 的決策樹，首先進行體外降解實驗，獲得代謝物譜的數據，綜合受試物分子結構中是否含有非天然的潛在安全性擔憂的化學基團，判斷是否需要開展放射性標記全面的ADME 研究。一般的，如果本類產品中修飾簡單（氧化，羧甲基化），可按低風險產品的研究策略，如修飾過程中引入復雜修飾（交聯劑），則按高風險產品的研究策略執行。例如，采用前者研究策略的氧化再生纖維類止血材料，體外降解為不同聚合度的寡聚糖或寡聚糖醛酸［23-33］，體內降解周期至少3 周［34-35］；采用后者研究策略的某纖維素止血材料，采用交聯劑修飾后，經體內放射性標記示蹤結合HPLC-MS分析發現此交聯劑以某小分子形式排出體外。這體現了中風險產品不同分子采取不同研究策略。

4 總結

綜上，可吸收止血材料作為外源物，為了臨床安全使用，需全面闡明體內代謝和處置動力學過程。放射性標記示蹤技術結合HPLC-MS 分析，是此類產品體內動力學研究的主要手段。本研究充分討論此方法的優劣勢和實驗關鍵考慮因素，提出在充分理論和體外實驗評估的基礎上，將可吸收止血材料按降解產物風險等級分為低、中、高三個水平，從科學的、全面的、經濟的角度分別優化研究策略和放射性標記示蹤技術結合HPLC-MS 分析方案，并總結了目前各風險等級產品在體外降解規律和體內代謝動力學的進展。以上為個人觀點，不代表任何機構，僅供參考。