超聲輔助提取紅豆多糖及其生物活性研究

邵 佩 莊 虎 謝 超 陳 勝

(1. 武漢黃鶴樓香精香料有限公司，湖北 武漢 430040；2. 湖北中煙工業有限責任公司，湖北 武漢 430040)

紅豆(VignaangularisW.)，屬豆科豇豆屬，又名紅小豆、小豆、赤小豆、赤豆，在中國陜西、江蘇、廣西等地方分布較廣[1]。紅豆藥用價值高，具有良好的健脾止瀉、解毒消腫、預防肝硬化等功效[2]。其食用價值也極高，含有豐富的蛋白質、碳水化合物，還含有多酚、多糖、黃酮等多種生物活性成分[3]。

試驗擬以紅豆為原料，采用超聲輔助提取法，以料液比、超聲溫度、超聲時間為考察因素，采用響應面法優化提取工藝，經脫蛋白、醇沉、透析工藝處理后，評價紅豆多糖的抗氧化及抑菌活性，以期提高紅豆多糖提取率，為紅豆的進一步開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與儀器

紅豆：湖北恩施生產；

透析袋：西安優博生物科技有限公司；

葡萄糖：標準品，美國Sigma公司;

乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、冰乙酸、三氯化鐵、30%雙氧水、硫酸亞鐵、水楊酸、過硫酸鉀等試劑：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)：標準品，上海源葉生物科技有限公司；

胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養基：青島海博生物技術有限公司；

金黃色葡萄球菌(6538)、大腸桿菌(25922)：美國標準生物品收藏中心；

沙門氏菌、枯草芽孢桿菌：由實驗室保藏。

1.1.2 主要儀器設備

高速粉碎機：DFY-300型，溫嶺市林大機械有限公司；

電子分析天平：AL204型，梅特勒—托利多儀器上海有限公司；

超聲波清洗機：KQ2200DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

旋轉蒸發器：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

紫外—可見分光光度計：UV-1750型，日本島津公司；

手提式壓力蒸汽滅菌鍋：TX-24LDJ型，江陰濱江醫療設備有限公司；

超凈工作臺：VD-1320型，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；

生化培養箱：SHP-250型，上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料預處理 紅豆樣品粉碎打粉后過60目篩，紅豆粉用80%乙醇溶液回流4 h以脫色并除去小分子多糖等，抽濾后將濾渣用無水乙醇、丙酮和乙醚分別清洗，粉末置于室溫下24 h陰干，得紅豆粉末待用[16-17]。

1.2.2 紅豆多糖的提取工藝流程

紅豆粉末→超聲波處理浸提→抽濾除渣→離心(8 000 r/min，10 min)→取上清液→在上清液中加入5%三氯乙酸至提取液不混濁(除蛋白)[18]→離心(8 000 r/min，20 min)→取上清液60 ℃下旋蒸至其體積的1/4左右→加入3倍體積的95%乙醇靜置24～48 h→抽濾→濾渣離心(8 000 r/min，20 min)后取沉淀→用無水乙醇洗滌并收集沉淀→將沉淀溶于蒸餾水透析48 h→冷凍干燥→得紅豆粗多糖

1.2.3 紅豆多糖含量的測定 采用苯酚—硫酸分光光度法[16]。以葡萄糖濃度(mg/mL)為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線y=5.286x-0.017,R2=0.999 2。

取2 mL稀釋提取液，加入體積分數5%苯酚溶液1 mL 和濃H2SO45 mL，充分混勻，室溫靜置30 min，于490 nm處測定吸光度，并使用標準曲線計算紅豆多糖含量[19]。按式(1)計算多糖提取率。

(1)

式中：

Y——多糖提取率，%；

V——多糖溶液的體積，mL；

c——葡萄糖的質量濃度，mg/mL；

n——稀釋倍數；

m——紅豆粉的質量，g。

1.2.4 紅豆多糖提取單因素試驗 準確稱取5 g紅豆粉末，用蒸餾水作溶劑，在100 W下進行超聲提取，測定紅豆多糖提取率。

(1) 料液比：固定超聲溫度40 ℃，超聲時間90 min，考察料液比[m紅豆∶V水分別為1∶8，1∶16，1∶24，1∶32，1∶40 (g/mL)]對紅豆多糖提取率的影響。

(2) 超聲溫度：固定料液比(m紅豆∶V水)1∶24 (g/mL)，超聲時間90 min，考察超聲溫度(20，30，40，50，60 ℃)對紅豆多糖提取率的影響。

(3) 超聲時間：固定料液比(m紅豆∶V水)1∶24 (g/mL)，超聲溫度40 ℃，考察超聲時間(30，60，90，120，150 min)對紅豆多糖提取率的影響。

1.2.5 響應面法優化試驗設計 在單因素試驗基礎上利用響應面法設計超聲波輔助提取的試驗方法，選取料液比、超聲溫度、超聲時間為影響因素，以紅豆多糖提取率作為試驗設計的響應值，根據Box-Benhnken試驗設計，利用三因素三水平的試驗設計優化超聲波輔助提取紅豆多糖工藝參數。

1.2.6 紅豆多糖體外抗氧化活性評價 根據文獻[20]進行，測定紅豆多糖的總還原能力，以及對·OH和ABTS+·的清除率。

1.2.7 紅豆多糖抑菌活性的測定

(1) 菌種活化：取各待測菌株于TSA培養基上37 ℃下倒置培養24 h，用生理鹽水洗斜面上的菌，充分震蕩使菌懸液的濃度為108CFU/mL，備用[21]。

(2) 抑菌活力的測定：采用文獻[21]中牛津杯法測定紅豆多糖對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌的抑菌活性。將熔化并冷卻的TSA培養基倒入平板內約15 mL，待凝固后加入100 μL的108CFU/mL菌懸液采用涂布法涂布均勻，在平板標記處放置牛津杯，并于每個牛津杯中吸入200 μL經0.22 μm過濾器過濾的10 mg/mL多糖溶液(每組3個平行)。于37 ℃培養箱培養24 h后，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑，以抑菌圈直徑作為抑菌活性的測定指標。

(3) 最低抑菌濃度(MIC)的測定：參照李彥坡等[22]的方法并根據實際情況有所調整。將紅豆多糖分別制成0.625，1.250，2.500，5.000，10.000，20.000 mg/mL 6個濃度梯度，采用涂布法測定，將1 mL不同濃度多糖溶液與25 mL培養基混勻，待培養基凝固后，加入4種供試菌的菌懸液100 μL，涂布均勻后，倒置培養24 h，每組試驗平行測定3次。

1.2.8 數據處理 采用Excel 2010處理數據和統計分析，Origin 8.0進行繪圖。試驗數據均重復3次，以平均值±標準偏差表示，以P<0.05表示差異顯著且具有統計意義。

2 結果與分析

2.1 紅豆多糖的提取工藝優化

2.1.1 單因素試驗結果 由圖1可知，料液比(m紅豆∶V水)選擇1∶16～1∶32 (g/mL)較合適；超聲溫度選擇40～60 ℃較合適；超聲時間選擇60～120 min比較合適。

圖1 3個因素對紅豆多糖提取率的影響

2.1.2 響應面試驗方案設計及結果 在單因素試驗基礎上，利用軟件Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken模式對料液比、超聲溫度、超聲時間進行三因素三水平的響應面試驗設計(見表1)，試驗設計方案及結果如表2所示。

2.1.3 回歸模型及方差分析 由表2可知，對試驗數據進行多元回歸擬合[23]，得到紅豆多糖提取率對料液比、超聲溫度、超聲時間的二次多項回歸方程：

Y=9.85+0.52A+0.39B+0.19C-0.45AB-0.06AC-0.17BC-0.81A2-1.40B2-0.65C2。

(2)

2.1.4 因素交互作用分析 由圖2可知，料液比和超聲溫度的交互作用極顯著(P<0.01)，料液比和超聲時間、超聲溫度和超聲時間的交互作用不顯著(P>0.05)，該結論與方差分析結果一致。

表1 響應面試驗因素及水平

2.1.5 最佳工藝條件的確定 利用Design-Expert 8.0.6軟件分析得到紅豆多糖的最佳提取工藝條件為：料液比(m紅豆∶V水)1∶26.33 (g/mL)，超聲溫度50.84 ℃，超聲時間93.69 min，此條件下預測的最佳提取率為9.95%。雖然表2中試驗號3和6提取率>10%，但考慮到試驗樣品的隨機性，以及預測值與試驗號3和6提取率值無顯著性差異(P>0.05)，故以Design-Expert 8.0.6軟件分析得出的最佳提取工藝條件進行驗證實驗。考慮到實際情況，將工藝條件適當調整為：料液比(m紅豆∶V水)1∶26 (g/mL)，超聲溫度51 ℃，超聲時間94 min，在該條件下進行3次平行試驗，紅豆多糖提取率平均值為(9.92±0.04)%，與預測最佳提取率基本一致，說明該模型優化結果可靠。

表2 紅豆多糖響應面試驗方案及結果

表3 回歸方程各項的方差分析?

2.2 紅豆多糖的抗氧化活性

2.2.1 總還原能力 由圖3可知，紅豆多糖的總還原能力與多糖濃度之間均呈現一定的量效關系。當多糖質量濃度為1～5 mg/mL時，隨著濃度升高，多糖的總還原能力顯著增加，與李粉玲等[13]的結論一致。當紅豆多糖質量濃度為5 mg/mL時，總還原能力最強，吸光值達(0.486±0.007)。表明紅豆多糖有較好的抗氧化能力，但顯著弱于維生素C的抗氧化能力(P<0.05)。

圖2 響應面及等高線圖

圖3 紅豆多糖總還原能力

2.2.2 清除·OH能力 由圖4可知，當多糖質量濃度為1～5 mg/mL時，隨著濃度升高多糖對·OH清除率逐漸增大。當質量濃度為5 mg/mL時，多糖對·OH清除率達(90.25±1.38)%，顯著低于同濃度下維生素C對·OH清除率(P<0.05)。試驗結果顯著高于李粉玲等[13]研究的紅豆多糖和鐘葵等[26]研究的綠豆多糖在同質量濃度下的·OH清除率，表明紅豆多糖對·OH有較強的清除能力。

2.2.3 清除ABTS+·能力 由圖5可知，當多糖質量濃度低于1.5 mg/mL時，多糖對ABTS+·清除能力存在量效關系，隨著濃度升高，多糖對ABTS+·清除能力增大；當多糖質量濃度為1.5～2.0 mg/mL時，對ABTS+·清除率的增長趨緩。當多糖質量濃度為2.0 mg/mL時，紅豆多糖對ABTS+·清除能力達到最大值(96.20±3.25)%，與維生素C的ABTS+·清除能力無顯著性差異(P>0.05)。許海燕等[27]研究顯示樺菌芝多糖在2.0 mg/mL時對ABTS+·清除率為90%，低于試驗結果，表明一定質量濃度下紅豆多糖對ABTS+·有較強的清除能力。

2.3 紅豆多糖的抑菌活性

2.3.1 抑菌圈直徑 由表4可知，紅豆多糖對金黃葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌具有不同程度的抑制作用，其中，紅豆多糖對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，抑菌直徑為(9.54±0.22) mm，與許海燕等[27]樺菌芝多糖對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑接近；對沙門氏菌和枯草芽孢桿菌的抑制較弱，抑菌圈直徑分別為(8.24±0.06)，(8.19±0.17) mm。紅豆多糖對4種供試菌的抑制作用強弱順序為金黃色葡萄球菌>大腸桿菌>沙門氏菌>枯草芽孢桿菌，表明紅豆多糖具有良好的抑菌效果。

圖4 紅豆多糖對·OH清除率的影響

圖5 紅豆多糖對ABTS+·清除率的影響

2.3.2 最小抑菌濃度 由表5可知，紅豆多糖對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌的MIC值分別為2.500，5.000，10.000，10.000 mg/mL，說明紅豆多糖金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強，對沙門氏菌和枯草芽孢桿菌的抑菌活性最弱。結果表明紅豆多糖的抑菌活性隨著濃度增大而增強，且對革蘭氏陽性菌的抑制作用強于革蘭氏陰性菌。

表4 紅豆多糖對4種供試菌的抑菌圈直徑?

表5 紅豆多糖對4種供試菌的MIC?

3 結論

通過單因素和響應面試驗確定了紅豆多糖的最佳提取工藝條件為：料液比(m紅豆∶V水)1∶26 (g/mL)，超聲溫度51 ℃，超聲時間94 min，此條件下多糖提取率為(9.92±0.04)%。對紅豆多糖的抗氧化及抑菌活性結果顯示：① 紅豆多糖具有較強的總抗氧化活性，但總還原能力及對羥基自由基、ABTS+自由基清除能力均低于維生素C；② 紅豆多糖對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌均有一定的抑制作用，且對金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強。此外，目前關于紅豆多糖的相關報道較少，后期研究可以從以下方面入手：① 試驗初探了紅豆多糖的抗氧化及抑菌活性，后面可對紅豆多糖抗氧化活性成分構效關系及抑菌機理展開研究；② 試驗提取的紅豆多糖為粗多糖，純度為62%，后續可對紅豆多糖進一步分離純化，提高多糖純度。