蒙藥瞿麥對小鼠的毒性作用研究

張 楠 張子英 王學梅 遲寶峰 蘇志剛 曹曉東

1.內蒙古醫科大學公共衛生學院慢性病分子流行病實驗室，內蒙古呼和浩特 010110；2.內蒙古醫科大學基礎醫學院，內蒙古呼和浩特 010110；3.內蒙古醫科大學GLP中心，內蒙古呼和浩特 010110

瞿麥（Dianthus superbus L）是傳統的蒙醫常用藥之一。蒙藥名為高優-巴沙嘎，屬石竹科多年生草本植物[1]。臨床應用廣泛，在玉簪清咽十五味散（丸）、肋柱花四味湯散、楓香脂十味丸、清肝九味散、沉香安神散等中均含有瞿麥[2]。研究表明，瞿麥具有興奮子宮、抑制細胞毒性、免疫調節、抗菌、抗氧化、抗腫瘤及利尿等作用[3]；在抗肝病毒、止痛、擴張血管、降低血壓及興奮腸管等方面也具有積極影響[2，4]。

關于瞿麥所產生的生物效應及機制研究，目前國內外主要關注的是化學成分及其藥理作用[4]。張建梅等[5]發現，栝樓瞿麥丸對糖尿病腎病大鼠腎臟有一定的保護作用。鄭桂敏等[6]用加減瓜蔞瞿麥丸治療復發性尿路感染的患者時發現，與應用呋喃妥因治療的患者相比，加減瓜蔞瞿麥丸有一定的療效且可有效控制復發率，并能改善患者細胞免疫功能。

據國內外文獻報道，目前從瞿麥中分離得到的化合物主要有皂苷類[7]、環肽類[8]、黃酮類、蒽醌類及有機酸類等，還含有少量的揮發油類、生物堿類[9]。根據文獻研究，皂苷具有肝臟毒性、腎臟毒性、胃腸道毒性、心臟毒性、遺傳毒性等[10-14]。蒽醌對腎、皮膚、膀胱、脾、甲狀腺、肝等有毒性作用[11]。同樣，含有皂苷和蒽醌類等成分的瞿麥可能也存在毒性。

通過上述文獻報道發現，有關瞿麥的毒理作用研究十分少見，在《中華人民共和國藥典（2015版）》[15]中也缺乏相關毒性作用的記載，且未見相關機制的研究。但是，研究瞿麥的毒理作用有助于推廣該藥的廣泛應用，使臨床應用更加合理。鑒于此，本研究通過短期給藥探索瞿麥對小鼠的潛在毒性作用，初步探討引起潛在毒性的劑量、靶器官和毒性機制，為瞿麥安全性評價提供科學依據，為臨床用藥提供安全信息。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康的清潔級昆明種成年小鼠，購自內蒙古醫科大學實驗動物中心[批準號：SCXK（蒙） 2015-0001]，18～ 22 g，雌雄各半，隨機分為四組，每組各10只。

1.1.2 實驗試劑及儀器 瞿麥（河北萬修藥業有限公司），生理鹽水（江西科達衛生用品公司），蘇木精-伊紅染色液（安徽雷根生物技術有限公司），甲醛（天津市風船化學試劑科技有限公司），總RNA小量制備試劑盒（Axygen公司），cDNA制備試劑盒（Vazyme公司），熒光染料（羅氏）。

1.2 實驗方法

1.2.1 瞿麥水煎劑的制備 稱取50 g瞿麥，加入超純水，大火煎開后轉小火煎1 h，濾出藥液，同樣方法煎第2次，兩次藥液混勻后，蒸發濃縮。

1.2.2 實驗動物分組與染毒 劑量設計采用臨床劑量法（ACD法）：根據《中華人民共和國藥典》規定，成人瞿麥每日用量為9～15 g，按成人標準體重60 kg算，本實驗設計的瞿麥高劑量為2.5 g/ml大約相當于臨床劑量的30倍。在該劑量下設定低、中劑量為0.25、0.5 g/ml，分別約相當于臨床劑量的5、10倍。臨床上瞿麥的給藥途徑通常為口服，而本實驗考慮到胃內容物對藥物劑量的影響以及藥物在胃內的首過消除效應，為確保給予實驗動物的藥物劑量準確，故選擇腹腔注射途徑給藥。

40只昆明種小鼠隨機分為瞿麥水煎劑高、中、低劑量組，空白對照組，每組各10只。瞿麥水煎劑各劑量組每日腹腔注射給藥1次，空白對照組腹腔注射給予同體積生理鹽水，連續給藥7 d。

1.2.3 實驗動物的一般觀察 實驗過程中每日給藥前后對小鼠的行為、活動、飲食飲水、毛色、糞便等變化進行觀察，并觀察注藥后小鼠的中毒反應。

1.2.4 肝、腎功能測定 眼眶靜脈叢取血至離心管，以2500 r/min，離心15 min后取上清液，用全自動生化儀進行血液肝、腎功能檢測。

1.2.5 實驗動物處理及取材 脫頸椎處死后稱重，解剖暴露肝、腎、肺、脾臟，將其完整剝離，用生理鹽水沖洗以去除殘留血液，將其浸泡于10%甲醛溶液中固定。

1.2.6 臟器指數測定 用電子天平準確稱量小鼠體重及肝、腎、肺、脾臟濕質量，記錄數據，并用肝、腎、肺、脾臟重量/體重，分別計算各臟器指數。

1.2.7 組織病理學檢測 制作組織病理切片，蘇木精 -伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色法染色，封片光鏡觀察，在光學顯微鏡目鏡10×，物鏡10×、20×、40×下觀察組織學變化。

1.2.8 腎組織總RNA的提取、cDNA的制備及qPCR檢測 按照 Axygen公司總RNA小量制備試劑盒說明書提取組織RNA；按照Vazyme公司HiscriptQRTSSuperMix試劑盒說明，獲得cDNA。總RNA上樣量為2.0 μl（約500 ng），反應條件：25 ℃，10 min；42 ℃，30 min；85 ℃，5 min。實時熒光定量PCR以制備的cDNA為模板，利用合成的特異性引物，通過qPCR方法擴增GAPDH、有機陰離子轉運蛋白1（OAT1）和有機陰離子轉運蛋白3（OAT3）的基因。反應條件是預變性95 ℃10 s，變性95 ℃ 5 s，退火 60 ℃ 34 s，共 40 個循環；從 65 ℃到95 ℃制作融解曲線。

qPCR所獲得的數據，利用2-△Ct（△Ct=目的基因Ct值-GAPDH Ct值）公式進行目的基因在腎組織上相對表達量計算。見表1。

1.3 統計學方法

采用SPSS 24.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用（）表示，當滿足正態性和方差齊時采用單因素方差分析，當不滿足時用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 qPCR中的引物序列及擴增片段大小

2 結果

2.1 各組一般觀察

實驗期間，瞿麥高劑量組和中劑量組的小鼠在腹腔注射后7 min左右出現明顯的腹部抽搐、蜷縮的癥狀，低劑量組有輕微的腹部抽搐的癥狀。高、中劑量組飲食飲水均下降，被毛缺乏光澤。在整個實驗過程中，高劑量組死亡小鼠共計6只，中劑量組4只。

2.2 各組肝、腎臟血生化檢測

瞿麥高劑量組升高了小鼠尿酸（uric acid，UA）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）的含量；瞿麥低劑量組升高乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、谷草轉氨酶（aspartate transaminase，AST）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）的含量。見圖1。

圖1 瞿麥對小鼠血生化的影響[瞿麥腎臟血生化檢測（A），瞿麥肝臟血生化檢測（B）]

2.3 各組肝、腎、肺、脾臟指數

瞿麥高、中劑量可顯著增加小鼠腎臟及肺臟指數；瞿麥低劑量能顯著增加小鼠脾臟指數。見圖2。

圖2 瞿麥對小鼠臟器指數的影響[瞿麥腎臟指數（A），瞿麥肝臟指數（B），瞿麥肺臟指數（C），瞿麥脾臟指數（D）]

2.4 各組肝、腎、肺、脾組織病理結果

隨著劑量的增加，肝臟組織邊緣區域逐漸出現凝固性壞死，壞死肝細胞周圍肝細胞氣球樣變，細胞核固縮，炎癥細胞浸潤。見圖3。

隨著劑量的增加，腎組織被膜逐漸增厚，被膜內疏松結締組織增長，炎癥細胞浸潤；腎皮質內管腔逐漸狹窄，管腔不規則；皮質內小管的上皮細胞體積增大，胞漿疏松，淡染，內有空泡，且癥狀隨著劑量的增加而加重，胞質流失，細胞壞死細胞核也逐漸消失。說明藥物對小鼠的腎組織有所損傷。見圖4。

隨著劑量的增加，肺臟組織出現肺泡內偶見蛋白滲出，肺泡壁炎癥細胞浸潤。見圖5。

隨著劑量的增加，脾臟組織被膜下，淋巴細胞減少，生發中心體積變小，邊緣區細胞丟失。見圖6。

圖3 瞿麥對小鼠肝臟組織的病理學檢測結果

圖4 瞿麥對小鼠腎臟組織的病理學檢測結果

圖5 瞿麥對小鼠肺臟組織的病理學檢測結果

圖6 瞿麥對小鼠脾臟組織的病理學檢測結果

2.5 腎臟損傷基因檢測

與空白組比較，瞿麥高劑量組能夠極顯著抑制OAT1和OAT3 mRNA的表達；瞿麥中、低劑量組可以顯著抑制OAT1和OAT3 mRNA的表達。

圖6 麥對小鼠腎臟中有機陰離子轉運體OAT1和OAT3 mRNA的影響[瞿麥對小鼠腎臟中有機陰離子轉運體OAT1 mRNA的影響（A），瞿麥對小鼠腎臟中有機陰離子轉運體OAT3 mRNA的影響（B）]

3 討論

本研究采用不同劑量的瞿麥水煎劑，通過肝、腎功能的血生化檢測，臟器指數分析，組織病理學檢測小鼠主要臟器組織形態變化；利用qPCR檢測了有機陰離子轉運體OAT1和OAT3在瞿麥引起小鼠毒性損傷中的作用。結果顯示，瞿麥中、高劑量組對小鼠各主要臟器均有不同程度的損傷，且腎臟尤為嚴重。因此，本研究探索瞿麥對小鼠腎臟損傷的分子機制，發現瞿麥各劑量組可不同程度的抑制有機陰離子轉運體mRNA的表達。

研究表明，瞿麥水煎劑會導致妊娠期小鼠在早、中期出現流產、死胎[3]。但是，瞿麥是否對腎臟、肝臟等主要臟器造成毒性還鮮有報道。目前，用于檢測腎、肝臟損害的毒性作用最常用的是血液生化檢測，尿肌酐和血尿素氮的濃度取決于腎排泄能力，可以在一定程度上反映腎小球濾過功能的損害程度，而ALP、ALT和AST是主要反映肝功能受損的指標。但血液生化檢測靈敏度較低，通常是在腎、肝臟組織已出現中度以上的明顯損傷后才升高[16]。本研究結果也顯示，瞿麥高劑量組升高了小鼠UA和BUN的含量，瞿麥低劑量組升高了LDH、ALP、AST的含量，但結果差異無統計學意義。病理結果表明，瞿麥對肝臟、腎臟已經有了明顯的損害，且腎臟病理學改變更嚴重。藥物對臟器系數的影響可以作為動物臟器損傷的初步指標。隨著瞿麥劑量的增加，腎臟系數也逐漸增加。因此，推斷腎臟是瞿麥產生毒性作用的主要靶器官。

腎臟的結構及生理功能使其易受藥物毒性成分的損害。腎臟損害主要表現為腎小球、腎小管損傷、導致腎缺血、間質性腎炎等。蒙藥對腎臟可能造成的損害不容忽視，而瞿麥在體內排泄的過程中是否對腎臟有所損傷，尚無相關研究報道。且在臨床上常用復方瞿麥治療慢性腎炎，糖尿病腎病等腎臟疾病。那瞿麥在何種劑量之下可以對腎臟有保護作用，在何種劑量下對腎臟有毒性作用？本研究使用的瞿麥低劑量為0.25 g/ml，相當于成人臨床劑量的5倍，已經造成腎臟的輕度損傷。盡管臨床上不會用到實驗劑量，但長期服用也許會通過積累導致腎臟的慢性損害。所以要注意嚴格控制臨床長期使用瞿麥的劑量。因此，研究瞿麥是否會造成腎臟的損傷，具有重要的臨床及理論研究意義。

OAT家族中的OAT1多表達在腎近曲小管上皮細胞基底膜側[17]；OAT3在腎近曲小管和腎小管各部位基底膜側都有表達。眾多內、外源性有機陰離子型化合物在腎小管處的分泌和重吸收，均是由它們介導的；是幫助哺乳動物排泄體內毒性物質的重要轉運體[18]，其對藥物的代謝作用有不可替代的位置[19]。而OAT1和OAT3在腎臟中表達的下調，可能導致腎臟產生炎癥，從而減少腎臟對毒性物質的分泌排泄和增加有機陰離子的積累[20-21]。本實驗中通過 mRNA分子水平的檢驗證實了瞿麥（0.25、0.50、2.50 g/ml）給藥7 d后，產生腎臟毒性損害時，OAT1和OAT3在腎臟組織內的表達量降低，腎臟病理切片結果也顯示腎臟出現大面積的炎癥浸潤；可見瞿麥有抑制腎小管上OAT的作用，直接導致腎臟毒性物質的積累，可能是瞿麥導致腎臟毒性作用的主要機制之一。

因此，為了確保民族醫藥的用藥安全，為患者的健康提供保障，迫切需要對中藥、蒙藥進行毒理研究，從而為尋找靶器官，解決蒙藥腎、肝等主要臟器損害的途徑和方法提供科學依據。