正交試驗法優(yōu)選光明護眼凝膠膏貼劑中總黃酮類成分提取工藝

司云珊 翟宏業(yè) 王 玉 馬 力 耿 琍

吉林省中醫(yī)藥科學院，吉林長春 130000

光明護眼凝膠膏貼劑是由青箱子和決明子等組成，具有清熱明目、清利頭目、明目退翳作用，用于緩解視疲勞癥狀（又稱視疲勞綜合征，visual display terminal，VDT）的保健用品。視疲勞又稱眼疲勞，是一種眼科常見病，其所引起的眼干、眼澀、眼酸脹、視物模糊甚至視力下降直接影響著人的工作與生活。眼疲勞主要是由于人們平時全神貫注看電視，電腦等電子產(chǎn)品屏幕時眼睛眨眼次數(shù)減少，閃爍屏幕強烈刺激眼睛而引起的，眼疲勞還會引發(fā)和加重各種眼病[1]。總黃酮提取和含量測定方法的研究一直是植物復方總黃酮研究的熱點問題，傳統(tǒng)的提取法有回流提取法、超聲波提取法等，還有醇類提取法、堿液提取法、系統(tǒng)溶劑提取法、微波加熱提取法。測定法有紫外分光光度法、液相色譜法、毛細管電泳法。紫外分光光度法相對簡單、快捷、價格低廉，樣品又可回收使用，是鑒定總黃酮類化合物的一種重要手段，筆者擬在考察影響總黃酮提取率單因素實驗的基礎上，采用正交設計進一步優(yōu)化提取工藝，為復方的綜合利用提供依據(jù)。本研究采用正交試驗法優(yōu)選光明護眼凝膠膏貼劑的提取工藝[2]，為本方進一步開發(fā)成凝膠膏劑提供實驗依據(jù)[3]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

尤尼柯UV2800紫外可見分光光度計（尤尼柯上海儀器公司）；Rephile一體式超純水機（Rephile Bioscience公司）；KQ-100DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；YP1002－電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；Al204電子天平（上海越平儀器有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；FW100小型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試劑與試藥

蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，100080-201408）。乙醇（北京化工廠，分析純）；亞硝酸鈉（天津科密歐化學試劑有限公司）。

本實驗所用藥材由長春中東健康萬家藥業(yè)有限責任公司提供，各藥材依照《2015版中華人民共和國藥典》項下規(guī)定自檢接符合規(guī)定，為本文實驗過程用藥。

2 方法與結(jié)果

2.1 標準溶液的配制

精密稱取蘆丁標準品適量，精密稱定90%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每毫升含0.63 mg蘆丁對照品溶液，備用。

2.2 最大吸收波長的選擇

精密量取蘆丁對照品5 ml，樣品溶液1ml，蘆丁加入10 ml甲醇再加1%三乙胺溶液定容至25 ml，樣品溶液加入7 ml純化水，再加1%三乙胺溶液定容至25 ml。以溶液為空白，在190～800 nm波長范圍內(nèi)掃描，蘆丁標準品與供試品均在360 nm處有最大吸收波長，見圖1。結(jié)果表明在此試驗條件下測定最大吸收波長為360 nm，故本實驗測定波長為360 nm。

圖1 蘆丁紫外-可見吸收全波長掃描圖

2.3 標準曲線的建立

精密稱取蘆丁對照品10.298 mg于100 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取此溶液于10 ml容量瓶中，配成濃度為0、5、10、15、20、25 μg/ml的樣品。精密量取各濃度的蘆丁對照品溶液2 ml置于25 ml容量瓶中，加10 ml甲醇，再加1%的三乙胺溶液定容至25 ml，以溶劑為空白，在360 nm處測吸光度，以吸光度（A）為縱坐標，質(zhì)量濃度（C）為橫坐標進行線性回歸。線性回歸方程為y=0.029x-0.019，相關系數(shù)r=0.9989，表明蘆丁標準品溶液在濃度為0～25μg/ml范圍內(nèi)濃度與吸光度的線性關系良好。見圖2。

圖2 蘆丁標準曲線圖[橫坐標為樣品濃度（C） 縱坐標為吸光度值（Abs）]

2.4 光明護眼凝膠膏貼劑工藝篩選正交試驗及結(jié)果

2.4.1 單因素實驗提取溫度的確定 文獻調(diào)研得知，乙醇的沸點在75～80℃，隨著溫度升高總黃酮溶解性增強，所以單次實驗提取溫度選擇為75℃。

2.4.2 單因素實驗過程提取時間的選擇 用粉碎機將復方粉碎，均分成3份，每份稱取1 g左右，在80%的乙醇中75℃溫度下回流提取30、60、90 min三個時間，測其黃酮含量，提取時間考察結(jié)果總黃酮提取率分別為0.073%、0.116%、0.137%。

2.4.3 單因素實驗過程乙醇提取濃度的篩選 將復方粉碎后均分成5份，每份稱取1 g左右，分別取50 ml 50%、60%、70%、80%、90% 的三種不同濃度乙醇中，在75℃下回流提取提取40 min。測其黃酮含量。結(jié)果總黃酮提取率分別為0.052%、0.068%、0.117%、0.165%、0.143%。

2.4.4 單因素實驗過程乙醇提取體積的確定 將復方粉碎，均分成3份，每份稱取1 g左右，分別加入 80% 的乙醇 10、15、20 ml，提取結(jié)束后，75 ℃下回流提取 30 min。測其黃酮含量。總黃酮提取率分別為0.154%、0.152%、0.156%。

2.4.5 工藝正交篩選試驗 正交設計影響光明護眼凝膠膏貼劑總黃酮含量的因素主要有提取次數(shù)（A）、加醇量（B）、提取時間（C）、醇濃度（D），故以這四個影響因素的3個水平[4]，采用L9（34）正交表進行實驗，以散痛風凝膠膏貼劑中總黃酮的百分含量為評估標準進行考察。各因數(shù)水平選取見表1。

表1 因素水平表

2.4.5.1 正交實驗結(jié)果 由2.4.3分析，以總黃酮提取率為指標的正交試驗結(jié)果分析，對結(jié)果進行統(tǒng)計和方差分析。從2.4.4極差可以看出，各因素對總黃酮類提取率影響的大小順序為乙醇體積分數(shù)（D）＞回流次數(shù)（A）＞乙醇用量（B）＞提取時間（D），提取醇濃度80%時總黃酮百分含量最高，為0.169%。正交結(jié)果分析可見，最佳優(yōu)選工藝為A3B1C2D3，即采用80%醇提取法，在提取3次，加醇量為6倍量，提取時間1.0 h。見表2。

表2 正交實驗表及結(jié)果

2.4.5.2 正交實驗的方差分析（表3）

表3 正交實驗的方差分析表

3 討論

通過醇提法的工藝篩選，優(yōu)選出了光明護眼凝膠膏貼劑總黃酮的較佳提取工藝80%醇提取，提取3次，加醇量為6倍量，提取時間1.0 h。篩選出的工藝操作簡單，省時節(jié)力，成本較低。采用三乙胺法[5]測定光明護眼凝膠膏貼劑中總黃酮百分的含量[6-20]，控制總黃酮提取的最佳條件，為光明護眼貼凝膠膏貼劑優(yōu)選出最佳提取工藝參數(shù)，合理可靠，簡單科學。為光明護眼貼凝膠膏貼劑提供實驗和大規(guī)模生產(chǎn)依據(jù)奠定理論基礎。